Apicidin对ADAM10的调控及其对阿尔茨海默病治疗的机制研究

作     者：胡小童 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈国俊

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100203[医学-老年医学] 10[医学] 

主      题：阿尔茨海默 ADAM10 apicidin SP1 USF1 

摘      要：研究目的:中药单体小分子高通量药物筛选发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂apicidin可显著增高pGL4.17-ADAM10的荧光素酶活性表达。故本研究旨在(1)在离体细胞中验证apicidin促进ADAM10表达;(2)研究apicidin促进ADAM10表达的基因调控元件和信号通路;(3)开发拥有我国自主产权的中药单体药物,进而为治疗AD提供新的实验依据。研究方法及结果:1.药物筛选及细胞水平研究发现apicidin对ADAM10有促进作用。通过分子克隆构建稳定表达pGL4.17-ADAM10荧光素酶报告基因的SH-SY5Y细胞系,并进行中药单体小分子高通量药物筛选发现,组蛋白去乙酰化酶抑制剂apicidin可显著增高pGL4.17-ADAM10的荧光素酶活性表达。在人胚胎肾细胞HEK293中,通过细胞活力测试、实时定量PCR及免疫印迹分析,研究apicidin的细胞毒性,及其对ADAM10的转录和翻译水平的影响。结果证实apicidin对ADAM10的转录和翻译具有促进作用。2.研究apicidin对ADAM10的作用调控元件。通过对ADAM10核心启动子区分析,用分子克隆的方法将其5个截短片段分别与pGL4.17连接,构建pGL4.17-ADAM10-C/D/E/E1/E2荧光素酶报告基因质粒,转染HEK293细胞24h后,加0.25uM的apicidin处理24h,用化学发光试剂检测转染不同截短片段的HEK293细胞中荧光素酶活性的表达。结果发现:转染了pGL4.17-ADAM10-E片段的细胞在apicidin处理后,与其他截短片段相比荧光素酶活性最强。查阅文献及对ADAM10-E片段的分析发现,此片段上主要存在有SP1及USF1两个结合位点。通过染色质免疫共沉淀(CHIP)验证了SP1、USF1与ADAM10启动子区的相互作用。再用RNA干扰技术下调神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中SP1与USF1的表达,在此基础上验证apicidin对ADAM10的促进作用是否存在,结果发现:USF1下调后,apicidin对ADAM10的促进作用基本消失,而下调SP1后,apicidin仍轻度的增加了ADAM10的表达,进一步验证了apicidin对ADAM10的促进作用主要通过影响USF1的活性产生。3.在SH-SY5Y细胞中研究apicidin对ADAM10调控的信号通路。通过免疫印迹分析,研究蛋白激酶C(PKC)抑制剂Calphostin C、蛋白激酶A抑制剂(PKA)H89、ERK途径抑制剂U0126、PI3K抑制剂LY294002、SP1抑制剂Mithramycin A及胰岛素对apicidin促进ADAM10表达的影响。结果发现:当抑制了ERK及SP1后,apicidin对ADAM10的促进作用明显下调。***对BACE1及APP降解途径的影响。通过荧光定量PCR及免疫印迹分析,加0.25uM的apicidin处理SH-SY5Y细胞48h后,检测BACE1在mRNA和蛋白水平的表达。结果发现:与对照组(等体积DMSO处理SH-SY5Y48h)相比,apicidin对BACE1的mRNA及蛋白水平均没有影响。将0.25uM的apicidin处理HEK-APP细胞48h后,用免疫印迹技术分析apicidin对APP降解途径的影响,结果发现:与对照组相比,apicidin处理后,APP表达未见明显变化,而α-CTF蛋白表达增多,β-CTF蛋白表达减少。研究结论:综上可知,组蛋白去乙酰化酶抑制剂apicidin可使ADAM10的表达上调,而此种作用可能主要通过ERK信号通路对USF1的活力进行调控产生的。同时,表达上调的ADAM10通过促进APP向非Aβ途径降解,减少了毒性Aβ的生成。因此,apicidin作为新的调控ADAM10表达的小分子药物,或有望成为治疗AD的有效策略。