Gli对食管腺癌OE19细胞生物学作用的体外实验研究

作     者：高明敏 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王雷

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：RNA干扰 食管腺癌 Hedgehog/Gli 细胞周期 上皮-间质转化 

摘      要：目的:目前对食管癌症患者的治疗多采取以手术、放化疗等为主的综合治疗,但是化疗药物疗效较差、毒副作用大,治疗效果不甚理想。近年来随着分子肿瘤学的快速发展,肿瘤的靶向治疗越来越得到人们的重视。Hedgehog(Hh)信号通路在胚胎期调控多种细胞的分化和生长,对维持成熟器官内环境稳定及人类多种恶性肿瘤的发展及转移密切相关。Gli作为Hh信号通路下游调控中心,其异常激活可以启动下游多种与肿瘤相关基因的转录。许多研究表明Gli基因通过多种机制可诱导多种癌症的发生,并且与多种癌症侵袭转移密切相关。近年来基因治疗作为一种全新的治疗模式显示出良好的应用前景,其中RNA干扰被公认为是细胞调节基因表达的关键机制。既往针对食管腺癌Hh通路的研究多集中在上游靶点Smo,针对Hh通路下游核心靶点Gli表达调控研究极少,所以本研究通过siRNA抑制Gli在食管腺癌OE19细胞中的表达,探讨了Gli表达下调对食管腺癌细胞生长和侵袭能力的影响及可能的分子机制,旨在为临床上食管腺癌的靶向治疗提供新思路。方法:将不同浓度(50nmol/L和100nmol/L)Gli1、Gli2siRNA和空白对照siRNA转染食管腺癌OE19细胞48h,实时荧光定量PCR法检测食管腺癌OE19细胞Gli1和Gli2mRNA表达水平;免疫印迹试验检测siRNA转染OE19细胞后Gli1、Gli2、Cyclin D1、Snail和E-cadherin蛋白表达水平;流式细胞术检测OE19细胞增殖和细胞周期分布;Transwell侵袭实验观察siRNA抑制Gli表达后对食管腺癌细胞侵袭转移能力的影响。结果:1食管腺癌OE19细胞Gli1mRNA和Gli2mRNA的表达将Gli1和Gli2siRNA组检测数据与control组(空白对照siRNA)相比较,Gli1siRNA中siRNA1mRNA和siRNA2mRNA较control组均显著降低,三组方差分析,差异比较有统计学意义(F=113.134,P=0.000),siRNA1mRNA与control比较,差异有统计学意义(P=0.000),siRNA2mRna与control比较,差异有统计学意义(p=0.000),sirna1mrna与sirna2mrna比较,差异有统计学意义(p=0.033);gli2sirna中sirna1mrna和sirna2mrna较control组均显著降低,三组方差分析,差异比较有统计学意义(f=262.329,p=0.000),sirna1mrna与control比较,差异有统计学意义(p=0.000),sirna2mrna与control比较,差异有统计学意义(p=0.000),sirna1mrna与sirna2mrna比较,差异有统计学意义(p=0.021)。2食管腺癌oe19细胞中蛋白表达westernblot结果表明:gli1蛋白表达各组间有显著性差异(f=1583.808,p=0.000);gli2蛋白表达各组间有显著性差异(f=529.058,p=0.000);snail蛋白表达各组间有显著性差异(f=1201.971,p=0.000);e-cadherin蛋白表达各组间有显著性差异(f=1742.273,p=0.000)cyclind1蛋白表达各组间有显著性差异(f=677.638,p=0.000);其中经sirna1处理细胞后gli1(p=0.000)、gli2(p=0.000)、snail(p=0.000)和cyclind1(p=0.000)蛋白表达均显著低于control组,e-cadherin(p=0.000)蛋白表达高于control组,差异均有统计学意义;与control组相比sirna2处理组gli1(p=0.000)、gli2(p=0.000)、snail(p=0.000)和cyclind1(p=0.000)蛋白表达均显著降低,e-cadherin(p=0.000)蛋白表达增高,差异均有统计学意义。经sirna2处理细胞后gli1(p=0.000)、gli2(p=0.000)、snail(p=0.000)和cyclind1(p=0.000)蛋白表达均低于sirna1组,e-cadherin(p=0.000)蛋白表达高于sirna1组,差异均有统计学意义;3细胞周期研究结果g0/g1期control组细胞为(42.62±2.25)%,sirna1组细胞为(58.68±2.43)%、sirna2组细胞为(67.39±3.21)%,三组比较方差分析结果(f=66.804,p=0.000),sirna1组显著高于control组,差异比较有统计学意义(p=0.000),sirna2组高于control组,差异比较有统计学意义(p=0.000),sirna2组显著高于sirna1组(p=0.000);s期control组细胞为(45.38±2.02)%,sirna1组细胞为(39.51±2.72)%、sirna2组细胞为(28.45±2.04)%,三组比较方差分析结果(f=42.525,p=0.000),sirna1组低于control组(p=0.032),sirna2组低于control组(P=0.000),SiRNA2组显著低于SiRNA1组(P=0.000),差异比较有统计学意义。G2/M期Control组细胞为(6.00±1.96)%,siRNA1组细胞为(5.81±2.01)%、SiRNA2组细胞为(5.16±2.34)%,三组比较方差分析结果(F=0.131,P=0.879),差异比较无统计学意义。4细胞侵袭能力实验结果各组间比较差别有统计学意义(F=797.079,P=0.000):与Control组穿膜细胞相对数表达量(1.00±0.01)比较,SiRNA1组穿膜细胞数相对表达量(0.72±0.01)明显减少(P=0.000),SiRNA2组穿膜细胞数相对表达量(0.33±0.01)较control明显减少(P=0.000)。SiRNA2组穿膜细胞数相对表达量(0.33±0.01)较SiRNA1(0.72±0.01)组明显减少(P=0.000)。结论:1 si RNA可以明显抑制食管腺癌OE19细胞中GlimRNA的表达,并且具有剂量依赖性。2 Hedgehog通路与食管腺癌生长增殖和上皮-间质转化(EMT)过程存在密切关系,当抑制Hedgehog通路时,其生长增殖和EMT过程被明显抑制。3 Gli在食管腺癌的生长转移中具有重要的作用,SiRNA通过下调Gli1和Gli2表达可抑制食管腺癌细胞周期分布和EMT能力,这可能与Gli调控CyclinD1、Snail和E-cadherin等蛋白变化有关,Gli有望成为抑制食管肿瘤转移的有效新靶点。