脂多糖致心肌细胞损伤的Kir6.2机制

作     者：杨中伟 

作者单位：第二军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：沈甫明

授予年度：2010年

学科分类：100218[医学-急诊医学] 1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：内毒素血症 心肌细胞 Kir6.2 α7nAChR 

摘      要：感染性休克也称败血症性休克或中毒性休克;是由病原微生物及其毒素在人体引起的一种微循环障碍状态,致组织缺氧、代谢紊乱、细胞损害甚至多器官功能衰竭;是一严重危害人类健康的综合征群,是外科危重病治疗中最常见的死亡原因,其死亡率高达30%-50%。众所周知,感染性休克时冠状动脉灌注不足,心肌缺血缺氧;心肌纤维变性、坏死或断裂、间质水肿、心肌收缩力减弱;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可损伤心肌线粒体、肌浆网、肌膜、收缩蛋白,亚细胞结构发生改变;三磷酸腺苷(ATP)产生和利用障碍,最终引发心力衰竭。ATP敏感钾通道(ATP-sensitive potassium channels, KATP)在心血管系统广泛存在,是一个大分子复合体,其分子组成是SUR和Kir6.x。SUR是受体单位,是钾离子通道激动剂或拮抗剂作用的靶点;Kir6.x是内向整流钾离子通道单位,其开放与否受SUR调节。在心肌细胞,细胞膜组成是Kir6.2/SUR2A;线粒体膜组成是Kir6.1/SUR1。研究认为开放KATP对于心肌缺血再灌注损伤具有保护作用;有趣的是SUR2基因缺失小鼠却具有抗缺血再灌注损伤作用;同样令人吃惊的是SUR1基因缺失小鼠也具有抗缺血再灌注损伤作用。但是,关于Kir6.2在LPS休克或血症对心肌细胞的影响未见报道。鉴于此,我们拟研究内毒素血症心肌细胞细胞损伤的Kir6.2机制。本课题主要研究内容包括: 第一部分,整体动物水平研究Kir6.2对LPS心肌细胞损伤和凋亡的影响整体动物水平,以C57小鼠(WT)和Kir6.2基因敲除小鼠(Kir6.2-KO)为模型,两种动物均分为:生理盐水对照组和LPS刺激90min、180min、360min组,共8组。利用HE染色技术检测各组心肌细胞组织病理学变化;利用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy ,TEM)技术检测各组心肌细胞超微结构变化;利用TUNEL法检测各组心肌细胞凋亡程度。发现对照组WT小鼠和Kir6.2-KO小鼠心肌细胞组织结构正常,超微结构正常,心肌细胞有轻微凋亡;在LPS刺激90min、180min、360min时间点,WT小鼠和Kir6.2-KO小鼠心肌细胞均出现了明显的组织病理学改变,超微结构改变和细胞凋亡。但是各时间点Kir6.2-KO小鼠心肌细胞的组织病理学改变、超微结构改变和凋亡程度均较WT小鼠明显。提示:Kir6.2对LPS心肌细胞损伤具有保护作用,具有抗LPS心肌细胞凋亡的作用。 第二部分,研究Kir6.2对炎症因子表达水平的影响 一、整体动物水平以C57小鼠(WT)和Kir6.2基因敲除小鼠(Kir6.2-KO)为模型,两种动物均分为:生理盐水对照组和LPS刺激90min、180min、360min组,共8组。利用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术检测各组动物的血清TNF-α、IL-1β表达水平。生理盐水组未检测到血清炎症因子表达,LPS刺激90min后,炎症因子表达最高,WT小鼠和Kir6.2-KO小鼠之间TNF-α和IL-1β的表达没有显著性差异;LPS刺激180min后,炎症因子表达有所下降,WT小鼠和Kir6.2-KO小鼠之间TNF-α的表达没有显著性差异,WT小鼠IL-1β的表达显著高于Kir6.2-KO小鼠;LPS刺激360min后,炎症因子表达明显下降,WT小鼠TNF-α和IL-1β的表达都显著低于Kir6.2-KO小鼠。结果表明Kir6.2影响小鼠血清炎症因子的表达。提示:Kir6.2缺失使血清炎症因子的表达增加。 二、细胞水平以C57小鼠(WT)和Kir6.2基因敲除小鼠(Kir6.2-KO)为模型,以小鼠腹腔来源的原代巨噬细胞为研究对象,利用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术检测细胞上清液的TNF-α表达水平。利用C57小鼠来源的腹腔巨噬细胞检测了生理盐水对照组和LPS刺激30min、60min、90min、180min和360min后各时间点的炎症因子表达水平。发现:在LPS刺激60min之前,炎症因子几乎无表达;在LPS刺激90min后,炎症因子开始大量表达;在LPS刺激180min后,炎症因子表达速率最大;360min的表达速率已降至较低水平。所以我们选取90min时间点研究Kir6.2不同功能状态时内毒素诱导的巨噬细胞炎症因子表达差异。发现:KATP开放剂吡那地尔显著降低WT小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子的表达,KATP阻断剂格列本脲显著升高WT小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子的表达。提示:激活KATP降低巨噬细胞炎症因子的表达;反之,阻断KATP增加巨噬细胞炎症因子的表达。对Kir6.2-KO小鼠来源的巨噬细胞炎症因子表达的影响,吡那地尔和格列本脲显示了类似的作用。提示:除Kir6.2外,Ki