亚硝酸钠对红色毛癣菌抑制作用的实验研究

作     者：谢红霞 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：佟盼琢

授予年度：2009年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100206[医学-皮肤病与性病学] 10[医学] 

主      题：红色毛癣菌 亚硝酸钠 一氧化氮 MTT 抑制率 电镜 

摘      要：目的:浅部真菌感染是皮肤科的常见病及多发病,其中红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）是最常见的一种皮肤癣菌,也是浅部真菌病的主要病原菌之一。红色毛癣菌属于亲人性皮肤癣菌,主要侵犯人的皮肤、指甲（趾甲）,偶可侵犯人的毛发。有研究统计90%的皮肤癣菌慢性感染是由该菌所致。最近报道红色毛癣菌不仅引起皮肤感染,也引起深部组织感染,发病率也在逐年升高。该菌所引起的真菌疾病较难治愈而且容易复发和再感染,从而导致患者生活质量的下降。 红色毛癣菌感染的浅部真菌病患者首选外用抗真菌药物,相对安全、便宜、方便,但由于患者依从性等问题,单用一种药物治疗往往耗时长,而且容易出现耐药现象。联合用药可以提高疗效,缩短治疗时间,提高治愈率。大量研究表明,NO作为活化巨噬细胞产生的一种细胞毒效应分子,能介导巨噬细胞抑制和杀伤病毒、细菌、真菌及寄生虫等病原体,是机体抗感染防御体系中的一个重要因子。既往研究证实真菌感染与机体免疫状态密切相关,而NO能直接影响机体的特异性免疫及非特异性免疫。许多研究者在体外试验和动物模型中发现NO在免疫系统中起作用,佟盼琢等研究了30例足癣和35例甲真菌病患者血清中NO和iNOS水平并与正常人群组比较,发现病例组均低于正常对照组水平且NO和iNOS水平呈直线正相关关系。足癣和甲真菌病患者血清NO和iNOS水平降低,也进一步证实了NO在真菌免疫中发挥一定作用。亚硝酸钠是一种化学物质,在酸中易得电子形成NO。近年来国外研究小组对亚硝酸盐的杀菌作用进行了体外实验研究,当pH为4.4时,5～10 mmol/ L的亚硝酸盐化合物可以抑制95 %以上的酵母菌生长,在同样的条件下也观察到酸性的亚硝酸盐化合物可以杀灭其它真菌和细菌。同时国外研究也证实了在酸性环境中亚硝酸盐对酵母菌,皮肤癣菌均具有较强的杀伤作用。临床研究局部应用酸性的亚硝酸盐制剂治疗由红色毛癣菌感染引起的甲真菌病患者16周后,大于90%患者的培养结果转为阴性;应用3%亚硝酸物乳膏治疗足癣4周,坚持完成整个疗程的19位患者中,18人完全治愈。这些体内外研究证实酸性的亚硝酸化合物是有效的抗真菌剂,但目前尚未见亚硝酸钠对红色毛癣菌抑菌情况和超微结构影响的报道。 MTT是一种测定细胞抑制率的方法,能以数值形式反映出药物对细胞的抑制情况。近年来应用于念珠菌,曲霉菌等的真菌药敏试验,证实是一种快速简便精确的抗真菌药敏实验终点判断方法。本研究中红色毛癣菌在含有不同浓度亚硝酸钠的沙氏液体药基培养96小时,通过MTT测定亚硝酸钠对红色毛癣菌的抑制作用。同时通过扫描电镜、透射电镜观察不同浓度和不同时间亚硝酸钠对红色毛癣菌超微结构的影响,为临床应用亚硝酸钠提供实验室依据。 材料和方法: 1菌株选择: 菌株为河北医科大学第二医院真菌室保存的典型红色毛癣菌,分离自体癣、股癣、足癣、甲真菌病等浅部真菌病患者。根据显微镜下特征、沙氏和马铃薯培养基菌落特征等鉴定菌种,选择红色毛癣菌30株。 2 MTT法测定不同浓度亚硝酸钠对红色毛癣菌的抑制作用:应用MTT法测定不同浓度亚硝酸钠在530nm的吸光度值以此量化对红色毛癣菌的抑制作用。 3亚硝酸钠对红色毛癣菌超微结构的影响: 3.1扫描电镜:观察不同浓度亚硝酸钠（160mmol/ L、80mmol/ L、40mmol/ L、20mmol/ L）作用于红色毛癣菌96小时,160mmol/L亚硝酸钠作用不同时间（48h、72h和96h）对红色毛癣菌超微结构的影响,同时设未加药物的生长对照组。 3.2透射电镜:观察80mmol/L亚硝酸钠作用96小时对红色毛癣菌超微结构的影响,同时设未加药物的生长对照组。 4统计学方法:应用SPSS13.0统计软件进行数据处理。首先应用SPSS 13.0软件计算不同浓度亚硝酸钠的抑制率,单因素方差分析比较不同浓度的抑制率,进一步两两分析采用LSD检验,P0.05为差异有显著性。 结果: 1 MTT法测定亚硝酸钠作用96h对红色毛癣菌抑菌结果:亚硝酸钠的浓度为160mmol/ L、80mmol/ L、40mmol/ L、20mmol/ L、10mmol/L、5mmol/L、2.5mmol/L、1.25mmol/L.作用96小时对红色毛癣菌抑制率依次为: （73.62+9.7%）、（71.93+1.47%）、（73.53+1.14%）、（70.80+1.50%）、（68.67+1.27%）、（41.76+1.53%）、（29.59+1.90%）、（16.98+1.82%）。随亚硝酸钠浓度减小,对红色毛癣菌的抑制率逐渐降低;经单因素方差分析P0.05,差异有统计学意义。进一步两两比较结果:160mmol/ L