鼻咽癌中EGFR调控APP和cystatin C信号通路及其功能的初步研究

作     者：邹海燕 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈主初

授予年度：2007年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：鼻咽癌 表皮生长因子受体 β淀粉样蛋白前体 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 

摘      要：鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)在世界大多数地方是一种非常罕见的恶性肿瘤，它容易与其它疾病混淆，误诊率高，至今为止对它的了解还很不足。它也是一种与EB病毒相关的恶性肿瘤，具有显著的种族和地方分布的特点，好发于东南亚，比其他地区发病率高出大约100倍。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)在大部分鼻咽癌有高表达，且与病人预后成负相关，有文献报道，用RNAi干扰鼻咽癌细胞的表皮生长因子受体可以使其生长减慢，诱导细胞周期停滞在G1期。 为了揭示EGFR在NPC发病中作用机制，本实验室应用无血清培养法培养NPC细胞系CNE2以消除牛血清中生长因子的影响，用EGFR配体——转化生长因子-α(TGF-α)刺激CNE2细胞24小时，采用双向凝胶电泳技术(two-dimensional electrophoresis，2-DE)分离TGF-α刺激组和对照组的分泌蛋白质，PDquest图像分析软件识别差异表达的蛋白质点，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达蛋白质，筛选到表皮生长因子受体调控的蛋白质8个，其中，β淀粉样蛋白前体(Amyloid beta A4 protein，APP)、核内不均一核糖核蛋白A1(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1，hnRNP A1)表达上调;而TPM4-ALK融合蛋白2、膜联蛋白A5(Annexin A5)、组织金属蛋白酶抑制剂2(Tissue inhibitor of metalloproteinase 2、TIMP-2)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C，Cys C)、14-3-3蛋白质的epsilon与zeta两种亚型表达下调。 APP在中枢神经系统中的异常酶解导致阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)．有文献报道APP在外周组织中的作用与细胞增殖，运动有关。近来发现APP在胰腺癌细胞中呈现高表达，分泌蛋白APP(sAPP)能够在收集的细胞培养上清中检测到。抑制sAPP信号可以抑制细胞增殖，APP可能主要通过sAPP信号促进胰腺癌细胞的生长。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C也是一种分泌蛋白质，在多种组织中表达，可以抑制组织蛋白酶(一种促进细胞侵袭，转移的半胱氨酸蛋白酶)的活性，此外，Cys C也能调节细胞的增殖。因此，Cys C被作为皮肤癌、直肠癌、肺癌的诊断和预后标志物。 因此，本实验选取APP和Cys C进行深入研究。首先通过Western blot和免疫组化检测EGFR、APP和Cys C的表达，探讨EGFR与APP、Cys的表达相关性及其与鼻咽癌发生发展的关系。结果显示：APP和Cys C的表达与EGFR表达密切相关。EGFR在鼻咽癌组织及颈部转移淋巴结中的表达高于鼻咽部正常粘膜上皮组织，且颈部转移淋巴结中的表达高于鼻咽癌组织，差异显著(P0.05);也发现APP在鼻咽癌组织表达高于鼻咽部正常粘膜上皮组织，两者间差异显著(P0.05)，而颈部转移淋巴结中的表达与鼻咽癌组织表达差异不明显。Cystatin C在鼻咽癌组织表达低于鼻咽部正常粘膜上皮组织，两者间差异显著(P0.05)，而颈部转移淋巴结中的表达与鼻咽癌组织表达差异不明显，同时对EGFR和APP、Cystatin C相关性分析，发现EGFR与APP呈正相关(r=0.586，P(0.01)，与CystatinC呈负相关(r=-0.396，P(0.01)。 为了明确调控APP和cystatin C活性的确切信号通路，本实验应用EGFR酪氨酸激酶的选择性小分子抑制剂PD153035，丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)抑制剂PD98059．磷脂酰激醇3激酶(PI3K)抑制剂wortmannin作用CNE2细胞后Westernblot检测两种分泌蛋白的表达变化情况，结果发现抑制PI3K这条信号通路之后，APP和cystatin C分泌明显发生变化。而抑制MAPK这条信号通路后APP和cystatin C分泌变化不是很大，这提示APP和Cystatin C可能主要通过PI3K这条信号通路调节，但MAPK这条信号通路也参与调节。同时为进一步了解APP蛋白在CNE2细胞生长中的作用，本实验应用抗体中和sAPP，经MTT和划痕实验，发现中和sAPP后细胞的增殖和运动能力减弱。 综上所述，本研究采用免疫印迹及免疫组化方法证实了在鼻咽癌