硼缺乏对汞致烟草BY-2细胞程序性死亡的影响及机制探讨

作     者：訾琳 

作者单位：大连医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘晓芳

授予年度：2015年

学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：Hg 毒性 硼缺乏 细胞程序性死亡 烟草 BY-2 细胞 氧化损伤 

摘      要：目的:由于人类大量工业活动及某些自然灾害,重金属污染已成为一项严重的世界性环境问题。汞(Hg)作为重金属元素之一,由于其本身的毒性、易流动性、易蓄积性及在生物圈的广泛分布,可对多种生物造成很多不利影响。微量元素硼(B)是植物的必需营养元素之一,硼缺乏已在多个国家有过报道,是农作物减产的重要原因之一。细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)是植物体内一些细胞通过自身遗传调控的一种高度有序性死亡方式。本研究的目的是探索Hg是否致烟草BY-2悬浮细胞发生程序性死亡,B缺乏对Hg诱导的细胞死亡的影响,并进一步探索调控该过程的可能机制。方法:本次实验选择烟草BY-2悬浮细胞系为研究系统。通过台盼兰染色法测定无硼条件下Hg诱导的烟草悬浮细胞存活率并在光学显微镜下观察细胞形态;采用Hochest33258染色法在荧光显微镜下观察细胞形态学变化;采用原位末端标记法(Td T—mediated dUTP N ick-End Labeling,TUNEL)检测DNA片段化;通过Real-time qRT-PCR技术检测细胞程序性死亡相关基因Hsr203j,cAPX及防卫基因PR-1a和PAL的表达。为进一步探讨无硼及汞致细胞程序性死亡的机制,采用生物化学方法检测无硼条件下Hg诱导的烟草悬浮细胞胞外过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。实验结果采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。结果:烟草BY-2悬浮细胞经30μM HgCl2处理24h后细胞存活率明显降低,无硼处理组在同样Hg应激条件下比单独Hg处理组细胞存活率下降,并随无硼处理时间的延长而降低。正常细胞经Hochest33258染色后呈淡蓝色荧光,无染色质凝集现象。HgCl2处理的细胞发生细胞质皱缩,细胞核出现不规则染色,发生染色质凝集。无硼培养的细胞经HgCl2处理后褶皱程度加大,细胞核部分边缘化,细胞核凝缩,有些甚至呈碎裂状。正常培养组细胞TUNEL阳性核比例低于1%,而30μM HgCl2诱导处理24h后约有28%细胞核呈TUNEL阳性核。无硼处理后,同样HgCl2诱导条件的细胞TUNEL阳性核比率增加,当无硼处理时间达到72h后TUNEL阳性率达到50%。HgCl2诱导的细胞Hsr203j,PR-1a,PAL基因表达量增加,cAPX显著性降低。无硼培养的细胞在Hg诱导下Hsr203j表达量比Hg单独处理组上升,而PR-1a,PAL比汞单独处理组有所下降。30μM HgCl2诱导4h后细胞胞外过氧化氢含量上升,无硼培养细胞Hg处理后胞外过氧化氢含量比单独Hg组上升。HgCl2诱导24h后MDA含量增加,无硼培养细胞Hg处理后MDA含量比单独Hg组上升。但无硼与汞联合组与汞单独处理组相比,胞外过氧化氢与MDA含量无显著性差异。结论:HgCl2可诱导烟草BY-2悬浮细胞发生程序性死亡,如细胞发生形态学变化,TUNEL阳性率升高,PCD相关基因Hsr203j表达量上调或c APX下调,防卫基因PR-1a和PAL表达上调。无硼培养的细胞HgCl2处理后比单独Hg处理组细胞发生程序性死亡的比率上升。同时,无硼培养与HgCl2联合作用可诱导细胞胞外过氧化氢、MDA含量上升,使细胞产生氧化损伤,表明细胞发生程序性死亡与氧化损伤途径有关。