吡咯并[2,3-d]嘧啶类叶酸拮抗剂的设计与合成研究

作     者：张闯 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杜玉民;王磊

授予年度：2015年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 100701[医学-药物化学] 

主      题：抗肿瘤 叶酸代谢 特异性 甘氨酰胺核苷甲酰基转移酶 合成 叶酸拮抗剂 

摘      要：叶酸代谢是人体内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成中的重要环节。以叶酸代谢为作用靶点的叶酸拮抗剂在临床上已经应用于抗肿瘤、抗微生物、抗原生生物和抗炎治疗。已上市的多个药物,如甲氨喋呤(methotrexate,MTX),培美曲塞(pemetrexed,PMX),雷替曲塞(raltitrexed)和2009年获批的普拉曲沙(pralatrexate)作为抗肿瘤化疗药物已广泛被国内外临床使用。胸苷酸合成酶(TS)和二氢叶酸还原酶(DHFR)是叶酸拮抗剂的两个重要作用靶。二氢叶酸还原酶在细胞内催化二氢叶酸还原为四氢叶酸,而胸苷酸合成酶是催化单磷酸脱氧尿苷(d UMP)从头合成单磷酸胸腺嘧啶核苷(d TMP)所需的酶。抑制二氢叶酸还原酶和胸苷酸合成酶将引起胞内还原态叶酸不足或者“胸苷酸缺陷状态,从而使得细胞无法完成精确的DNA复制,最终导致细胞死亡。除二氢叶酸还原酶和胸苷酸合成酶外,嘌呤从头合成中依赖叶酸发挥作用的两个酶,甘氨酰核苷酸甲基转移酶(GARFTase)和氨基咪唑甲酰胺核苷酸甲基转移酶(AICARFTase)也可以作为叶酸拮抗剂的靶点。临床应用的经典叶酸拮抗剂作为一类抗代谢药物,虽然已经取得巨大成功的药物,但是仍具有选择性差、毒副作用大的缺点。其分子结构中用于模拟天然叶酸分子中的谷氨酸侧链,在生理p H下,被电离而使药物分子带负电荷,进而难以通过被动转运的方式进入细胞内发挥作用。人体内转运叶酸和经典叶酸拮抗剂的载体主要包括叶酸受体(FR)、还原叶酸转运蛋白(RFC)和质子偶联叶酸转运体(PCFT),其中RFC是生理p H条件下转运叶酸的主要载体。目前临床使用的经典叶酸拮抗剂均为RFC的底物,在进入肿瘤细胞的同时无选择性的进入正常人体细胞,无法选择性杀死肿瘤细胞。而FR和PCFT在正常组织中有限表达,在肿瘤细胞中广泛表达,为选择性抑制肿瘤细胞提供了新的有效靶点。已报道的一系列6-取代吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物是FR和PCFT特异性底物而非RFC底物,相比目前应用于临床的叶酸拮抗剂MTX和PMX具有更好的选择性。该类化合物分子内作用靶点为甘氨酰胺核苷甲酰基转移酶(GARFTase)。在此工作基础上,本课题通过设计并合成新型叶酸拮抗剂,对前期工作中已经发现的选择性被FR和PCFT转运的化合物进行进一步的优化和改进,得到更好的药物前体,早日进入临床试验;通过研究PCFT的结构特征和转运机制,发现特异性结合PCFT的小分子,发掘其构效关系,论证其作为肿瘤靶向治疗的新型目标靶点。目的:合成两个系列的6-取代-吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物。方法:以2,4-二氨基-6-羟基嘧啶和4-氯乙酰乙酸乙酯为原料,经过合环、水解,得到2-氨基-4-氧-6-乙酸-吡咯并[2,3-d]嘧啶4。化合物4分别与对氨基苯甲酸甲酯5、对甲氨基苯甲酸甲酯6、对氨甲基苯甲酸甲酯盐酸盐7和4-哌啶甲酸甲酯盐酸盐8以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、1-羟基苯并三唑(HOBt)为催化剂进行酰化反应,生成2-氨基-4-氧-6-(乙酰-4-甲酸甲酯苯胺)-吡咯并[2,3-d]嘧啶9、2-氨基-4-氧-6-(乙酰-4-甲酸甲酯-N-甲基苯胺)-吡咯并[2,3-d]嘧啶10、2-氨基-4-氧-6-(乙酰-4-甲酸甲酯苯甲胺)-吡咯并[2,3-d]嘧啶11和化合物12四个重要中间体。合成的四个重要中间体水解后,分别和2-氨基吡啶17、3-氨基吡啶18、2-氨甲基吡啶19、4-氨甲基吡啶20、L-谷氨酸二乙酯盐酸盐37、和3-硝基苯胺46分别以2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)、N-甲基吗啉(NMM)为催化剂和以EDCI、HOBt为催化剂进行酰化反应,得到24个6-取代吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物,其中4个经典叶酸拮抗剂,20个非经典叶酸拮抗剂通过熔点、质谱、核磁等手段对各中间体和目标化合物进行鉴定。结果:按照设计的路线合成了两个系列系列6-取代吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物共24个并通过1H-NMR和MS-ESI(m/z)对结构进行了初步确认。另外,对工艺中一些反应条件进行了优化。结论:完成了两个系列6-取代吡咯并[2,3-d]嘧啶类化合物的合成。优化了合成工艺,实验所用原料廉价易得,条件温和,操作简便。