生姜等内生真菌的分离鉴定及其次级代谢产物抗肿瘤活性研究

作     者：刘璐 liulu

作者单位：兰州理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蒲秀瑛

授予年度：2016年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：内生真菌 生姜 百合 山药 苦瓜 分离鉴定 抗肿瘤活性 

摘      要：随着社会经济的发展和进步,环境污染日趋严重,癌症的发病率也逐日升高,已经成为危害人类健康的第二大杀手。从植物中分离内生真菌以期待寻找与宿主有相似抑癌活性的次生代谢化合物已成为目前抗癌药物开发的重要手段和方法。本研究以4种药食同源植物为研究对象,通过平板分离法分离植物内生真菌,经平板划线法纯化分离的内生真菌,对所分离的内生真菌发酵产物进行了抗肿瘤活性的筛选,并对抗肿瘤活性较强的菌株进行了形态学和分子生物学的鉴定。1、内生真菌的分离和纯化:采用平板分离法从生姜、山药、苦瓜和百合四种药食同源植物中分离内生真菌,并通过平板划线法纯化分离到的菌株,共得到内生真菌总计58株。2、内生真菌的形态学鉴定:利用形态学对实验前期46株内生真菌进行了初步鉴定,结果显示,这些菌株分属于青霉属、酵母属、镰孢菌属、曲霉属和木霉属等21个属,菌种比较丰富,其中菌株BH-F属于木霉属,菌株BH-A在培养基上未见到孢子,未通过形态学鉴定。3、内生真菌的液体培养及发酵产物的处理:以分离得到的58株内生真菌为发酵菌株,分别进行液体培养,并对其发酵液和菌丝体分别进行乙酸乙酯萃取和95%乙醇回流提取,获得60个内生真菌的发酵产物。4、抗肿瘤活性菌株的筛选:以人肝癌细胞系HepG2、人肺腺癌细胞系A549、子宫颈癌细胞系HeLa、人胃癌细胞系SGC7901和耐阿霉素胃癌细胞系SGC7901/ADR 5种肿瘤细胞为研究对象,采用MTT法对以上60个内生真菌的发酵产物进行抗肿瘤活性的初步筛选,结果显示,其中18个发酵产物至少对一种肿瘤细胞株显示了细胞毒性,占供试样品总数的30%,分属于14种菌株。接着对14株活性菌株的发酵产物进一步复筛,分别测定其对各种肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC)。结果表明,菌株BH-A和BH-F的发酵产物抗肿瘤活性最佳,优于其它菌株。5、菌株BH-A和BH-F的分子生物学鉴定:通过PCR法扩增BH-A和BH-F的ITS保守序列,对其进行分子学鉴定,结果显示,菌株BH-A为Trametes versicolor,菌株BH-F为木霉属。