GSK3β及其显性负突变体的原核表达与纯化

作     者：王建瑛 高玲梅 刘小会 高学娟 刘朗夏 

作者机构：暨南大学生命科学技术学院/生命与健康工程研究院广东广州510632 

出 版 物：《南京医科大学学报（自然科学版）》 (Journal of Nanjing Medical University(Natural Sciences))

年 卷 期：2011年第31卷第11期

页      面：1556-1560,1565页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学青年科学基金资助(21310037) 

主　　题：GST-GSK3β GST-GSK3β1K85M 融合蛋白 表达 纯化 

摘      要：目的:构建原核表达GST-GSK3β1、GST-GSK3β2及其显性负突变体(dominant-negative mutant)GST-GSK3β1 K85M的重组质粒,并进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定。方法:利用PCR扩增和基因重组技术,以含有人源目的片段的质粒Flag-GSK3β1、YFP-GSK3β2及Flag-GSK3β1 K85M为模板,扩增出相应的目的基因片段,并将其插入具有GST标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST融合蛋白表达质粒。通过对GST-GSK3β1、GST-GSK3β2和GST-GSK3β1 K85M融合蛋白进行诱导表达、温和法裂解以及纯化实验,确立有效的表达和纯化方法。最后应用Western blot方法鉴定纯化的融合蛋白。结果:成功构建GST-GSK3β及其显性负突变体质粒,并通过诱导表达和纯化得到目的蛋白。结论:GST-GSK3β1、GST-GSK3β2及GST-GSK3β1K85M显性负突变体质粒的成功构建及目的蛋白的表达与纯化,为更深入地研究GSK3β蛋白的生物学功能奠定基础。