慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

作     者：覃鸿妮 谢钰珍 杨晨晨 张勇 QIN Hongni;XIE Yuzhen;YANG Chenchen;ZHANG Yong

作者机构：苏州工业园区服务外包职业学院高通量基因测序工程技术研发中心江苏苏州215123 金唯智生物科技有限公司江苏苏州215123 

出 版 物：《扬州大学学报（农业与生命科学版）》 (Journal of Yangzhou University：Agricultural and Life Science Edition)

年 卷 期：2020年第41卷第4期

页      面：29-35,45页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

基　　金：江苏高校自然科学研究面上项目(18KJD180005) 江苏省高职院校教师专业带头人高端研修项目(2019GRFX093)。 

主　　题：CRISPR/Cas9 慢病毒载体 细胞系 基因编辑 

摘      要：为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑,PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞,48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在106 TU·mL-1之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。