FNDC5过表达慢病毒载体的构建及稳定转染THP-1细胞系

作     者：覃铮 刘大男 肖金翠 何青松 Qin Zheng;Liu Danan;Xiao Jincui;He Qingsong

作者机构：贵州医科大学附属医院心内科、贵州医科大学医学科学研究所贵阳550004 

出 版 物：《重庆医科大学学报》 (Journal of Chongqing Medical University)

年 卷 期：2020年第45卷第2期

页      面：212-216页

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(编号:81660083) 贵州省高层次创新型人才培养计划资助项目(编号:黔科合人才〔2015〕4026号) 贵州省社会发展公关资助项目(编号:黔科合SY〔2013〕3017号)。 

主　　题：FNDC5基因 动脉粥样硬化 慢病毒载体 稳转细胞系 

摘      要：目的:构建过表达Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5(fibronectin typeⅢdomain-containing protein 5,FNDC5)基因的慢病毒载体,获得稳定转染FNDC5的THP-1细胞系。方法:PCR扩增目的基因FNDC5,将目的基因构建入pLenti-EF1a-EGFPP2A-Puro慢病毒载体中,在DH5α感受态细胞中进行扩增,测序及鉴定合格后利用四质粒包装系统转染293T细胞,包装成过表达慢病毒颗粒并测定病毒滴度。Western blot检测重组慢病毒中FNDC5的表达情况后,将获得的重组慢病毒转染THP-1细胞系,荧光显微镜观察并计算其转染效率。经嘌呤霉素筛选建立FNDC5过表达的稳转细胞系后,将细胞分为3组,分别为空白组、空载组和FNDC5组,用Western blot及RT-PCR检测其FNDC5的表达情况。通过油红O染色后观察FNDC5过表达对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积的影响。结果:PCR产物鉴定及测序结果显示成功构建FNDC5过表达慢病毒载体;转染293T细胞后可检测到绿色荧光,Western blot检测FNDC5-Flag标签有表达,包装后病毒的滴度为1.32×10^9 TU/mL;Western blot及RT-PCR检测重组慢病毒转染THP-1细胞系,与空载组对比,FNDC5组中FNDC5蛋白表达明显增加[(238.0±24.9)%],有统计学意义(P=0.000);与空载组对比,FNDC5组中FNDC5 mRNA表达水平明显增加[(228.5±3.4)%],有统计学意义(P=0.000)。FNDC5过表达转染THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中的脂质蓄积减少。结论:本实验成功构建了FNDC5基因的过表达慢病毒载体,通过FNDC5过表达慢病毒感染建立了FNDC5稳转的THP-1细胞系,证明FNDC5可明显减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的脂质蓄积,为后续研究奠定基础。