丹参多酚氧化酶互作的蛋白筛选与验证

作     者：张海星 时王珂 郭蓉 张跃进 郭宏波 ZHANG Hai-xing;SHI Wang-ke;GUO Rong;ZHANG Yue-jin;GUO Hong-bo

作者机构：西北农林科技大学化学与药学院旱区作物逆境生物学国家重点实验室中药指纹图谱与天然产物国家地方联合工程研究中心陕西杨凌712100 西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100 

出 版 物：《中国中药杂志》 (China Journal of Chinese Materia Medica)

年 卷 期：2020年第45卷第11期

页      面：2523-2532页

核心收录：

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

基　　金：陕西省自然科学基金项目(2016JM8108) 中央高校基本科研业务费专项(2452016003) 

主　　题：丹参 多酚氧化酶 蛋白互作 酵母双杂交 BiFC 

摘      要：多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是植物体内重要的抗氧化酶,它具有清除活性氧和合成酚类、木质素和植保素等功能,能增强植物抗逆和抵御病虫害能力。课题组前期研究发现丹参PPO基因能正向调控丹酚酸B合成。为深入探究其机制,该文以克隆的丹参多酚氧化酶基因(SmPPO,GenBank登录号KF712274.1)构建了pGBKT7-PPO诱饵载体,验证了其无自激活、无毒性。实验室构建的丹参cDNA文库滴度为4.75×107 cfu·mL-1,符合建库要求。通过酵母双杂交试验筛选出22个可能与SmPPO互作的蛋白。通过酵母共转化验证得到只有PAL1和TAT与SmPPO互作,通过双分子荧光互补检测(BiFC)进行进一步验证,获得只有TAT与SmPPO互作,故确定TAT与SmPPO互作。分别对TAT和SmPPO按照结构域进行截短,获得SmPPO前126个氨基酸和酪氨酸氨基转移酶(TAT)在细胞膜和叶绿体上互作。通过亚细胞定位试验获得SmPPO主要定位于细胞核和细胞膜上;TAT定位于细胞膜上。实时荧光定量PCR结果表明SmPPO基因主要在根和茎中表达;TAT基因在根中表达,茎和花中表达量较低。该文为深入研究丹参SmPPO与TAT互作调控酚类物质合成的分子机制奠定了坚实基础。