花生AhLea-D基因的克隆及耐盐性验证

作     者：姜平平 潘雷雷 黄建斌 纪红昌 唐艳艳 于明洋 朱虹 隋炯明 王晶珊 乔利仙 JIANG Ping-Ping;PAN Lei-Lei;HUANG Jian-Bin;JI Hong-Chang;TANG Yan-Yan;YU Ming-Yang;ZHU Hong;SUI Jiong-Ming;WANG Jing-Shan;QIAO Li-Xian

作者机构：青岛农业大学农学院/山东省花生产业协同创新中心 青岛农业大学生命科学学院/山东省高校植物生物技术重点实验室 青岛福德隆食品有限公司 

出 版 物：《农业生物技术学报》 (Journal of Agricultural Biotechnology)

年 卷 期：2020年第28卷第5期

页      面：811-822页

核心收录：

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

基　　金：国家自然基金(31872875) 农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室开放课题基金资助(KF2018008) 

主　　题：花生 花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因(AhLea-D) 过量表达 遗传转化 耐盐性 

摘      要：花生(Arachis hypogaea)属于中度耐盐作物,可在0.3%的盐碱地上正常生长,但产量会因盐胁迫造成的伤害而减产,挖掘花生耐盐基因、创制耐盐种质、选育耐盐品种成为花生在盐碱地有效利用的关键问题。本研究利用已构建的花生耐盐突变体及其诱变亲本转录组数据库,对花生中的胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant proteins, Lea)基因进行差异表达筛选,获得盐胁迫差异表达基因AhLeaD。为了进一步研究AhLea-D基因与花生耐盐性的关系,从花生耐盐突变体中克隆AhLea-D基因(GenBank No. MN393179)全长c DNA序列,该序列全长534 bp,编码的AhLea-D蛋白含有177个氨基酸,分子量为17.89 kD,等电点为5.78,为酸性蛋白。亲水性平均系数为-0.983,蛋白的不稳定指数小于40,属于稳定的亲水性蛋白。构建AhLea-D基因的过表达载体PCAMBIA1301-AhLea-D,并利用花粉管通道法转入花生受体品种’花育23’。收获所注射花蕾上的荚果,利用PCR扩增法对收获的籽粒进行分子鉴定,结果表明转基因籽粒阳性率为52%。q RT-PCR检测结果表明,转基因植株中AhLea-D基因的表达量是非转基因对照植株的7～12倍。利用250 mmol/L NaCl对转基因植株和非转基因对照植株进行盐胁迫处理,1周后对照植株叶片出现明显的萎蔫、发黄现象,而转基因植株无明显变化。转基因植株的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率等均高于对照植株,而胞间CO2浓度低于对照植株。转基因植株中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)的酶活性均显著高于非转基因对照植株,而丙二醛(malonic dialdehyde, MDA)含量则显著低于非转基因对照植株(P0.05)。本研究结果表明,AhLea-D基因的过量表达提高了转基因花生的耐盐性。本研究结果将为在花生中开拓新的抗逆育种途径提供理论依据,并为花生抗逆耐盐育种提供耐盐新基因。