利用CRISPRCas9技术构建TGFBI敲除的Met-5A稳定细胞株

作     者：杨杰 郑晋南 兰亚佳 张勤 YANG Jie;ZHENG Jin-nan;LAN Ya-jia;ZHANG Qin

作者机构：四川大学华西公共卫生学院/四川大学华西第四医院 

出 版 物：《现代预防医学》 (Modern Preventive Medicine)

年 卷 期：2019年第46卷第15期

页      面：2837-2841页

学科分类：0710[理学-生物学] 1002[医学-临床医学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：四川省卫生和计划生育委员会科研课题2016年普及应用项目(编号:16PJ261) 

主　　题：CRISPR/Cas9 TGFBI Met-5A细胞 恶性胸膜间皮瘤 

摘      要：目的利用CRISPRas9基因编辑技术构建TGFBI敲除的Met-5A稳定细胞株,为进一步深入研究TGFBI低表达在人膜间皮细胞恶性转化过程中的功能角色提供技术支持。方法根据CRISPRas9靶点设计原则针对TGFBI基因第4号外显子设计2对sgRNA(小向导RNA),退火形成双链,连接至Bsmbl酶切后的载体质粒lentiCRISPRv2(命名为lentiCRISPRv2-T1和lentiCRISPRv2-T2),经感受态细胞扩增后提取质粒并测序验证。提取和纯化正确插入目的片段的重组质粒,经慢病毒包装并转染Met-5A细胞,嘌呤霉素筛选阳性克隆。提取细胞及上清液总mRNA和蛋白,使用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和免疫印迹实验(Western blot)检测慢病毒系统转染后TGFBI mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经基因测序后证实lentiCRISPRv2-T1、lentiCRISPRv2-T2重组载体质粒均正确插入了sgRNA序列;慢病毒系统转染Met-5A细胞后,v2-T1、v2-T2组TGFBI mRNA相对表达水平相比对照组明显降低(P0.05),且v2-T2组TGFBI mRNA相对表达水平低于v2-T1组(P0.05);v2-T1组TGFBI蛋白表达量下降为对照组的0.03倍,在v2-T2细胞中几乎检测不到TGFBI蛋白。结论构建了针对TGFBI第4号外显子的两组sgRNA-lentiCRISPRv2敲除载体;成功获得了TGFBI敲除的Met-5A稳定细胞株,为进一步研究TGFBI低表达在恶性胸膜间皮瘤发生发展过程中的分子机制奠定了基础。