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丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶基因克隆与原核表达

Cloning of RNA-dependent RNA polymerase(RdRp) gene of HCV and its expression in *** system

作     者:陈忠斌 陆军波 管伟 王升启 Chen Zhongbin;Lu Junbo;Guan wei;Wang Shengqi

作者机构:军事医学科学院放射医学研究所北京100850 

出 版 物:《生物技术通讯》 (Letters in Biotechnology)

年 卷 期:2000年第11卷第4期

页      面:244-248页

学科分类:1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

基  金:军事医学科学院科技创新基金 (项目号 980 5 10 7)资助 

主  题:丙型肝炎病毒 RNA聚合酶 克隆 表达 

摘      要:丙型肝炎病毒 (HCV)依赖于RNA的RNA聚合酶 (RdRp)是参与病毒基因组RNA复制的一个关键蛋白因子 ,是研究抗HCV新型药物的重要靶标 ,获得纯化的RdRp产物是建立靶向RdRp药物高通量筛选体系和抗病毒药物研究的关键步骤。以HCV病毒基因组全长cDNA质粒 (p90 HCVFL longpU)为模板 ,设计了特异性扩增RdRp的引物 ,通过CPR扩增获得编码RdRp的基因。将该基因克隆到T载体中 ,构建了重组质粒 ,通过克隆快速筛选和酶切分析筛选到含RdRp基因的阳性克隆(克隆号为 4 4 ) ,DNA序列分析证实 4 4号阳性克隆RdRp基因序列与cDNA质粒中的相应序列完全一致。将含RdRp基因的重组质粒 (44号 )用NheⅠ XhoⅠ双酶切 ,获得RdRp基因 ,将该基因连接到用NheⅠ XhoⅠ双酶切的原核表达载体pET2 8(a)中 ,构建了重组质粒pET2 8(a) NS5B ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经 1mmol LIPTG诱导 ,SDS PAGE分析 ,发现一条特异性蛋白带 ,相对分子质量约 6 6× 10 3 ,与预期的完全一致。HCVRdRp基因的克隆与表达为靶向RdRp的新型抗HCV药物研究 。

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