两种重组蛋氨酸酶表达条件优化及其对人肺腺癌细胞GLC的抑制作用研究

作     者：罗沈强 田长富 LUO Shenqiang;TIAN Changfu

作者机构：重庆医科大学附属第三医院(捷尔医院)药剂科重庆401120 昆明医科大学科研实验中心昆明650500 

出 版 物：《中国药房》 (China Pharmacy)

年 卷 期：2019年第30卷第12期

页      面：1634-1639页

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

基　　金：云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项资金资助项目[No.2018FE001(-194)] 

主　　题：重组蛋氨酸酶 诱导条件 单因素试验 GLC细胞 抑制作用 

摘      要：目的:优化两种重组蛋氨酸酶表达的诱导条件,并探讨其对宣威人肺腺癌细胞GLC的抑制作用。方法:将重组蛋氨酸酶表达质粒PGEX-4T1-4A1-MGL和PGEX-4T1-3B8-MGL转染至感受态大肠杆菌DH5α中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。以目标蛋白表达量为指标,采用单因素试验对诱导前菌液起始光密度(OD600 nm)值、培养温度、诱导时间等诱导条件进行优化。采用亲和层析法对所得重组蛋氨酸酶4A1-MGL、3B8-MGL进行纯化;采用考马斯蓝法检测其质量浓度,十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测其纯度,分光光度法检测其活性。采用MTT法检测经低、中、高剂量重组蛋氨酸酶(4A1-MGL和3B8-MGL分别均为0.1、0.2、0.4 U/mL)作用24、48、72 h后的细胞增殖情况,并计算细胞抑制率。结果:两种重组蛋氨酸酶表达的最优诱导条件为菌液起始OD600 nm值0.9、培养温度37℃、诱导时间5 h。验证试验结果显示,4A1-MGL、3B8-MGL的蛋白表达量分别为1.52±0.04、1.28±0.03(RSD3%,n=3)。经纯化后,4A1-MGL的质量浓度为(0.70±0.02)mg/mL,纯度为(96.42±3.15)%,活性为(0.45±0.02)U/mg;3B8-MGL的质量浓度为(0.56±0.02)mg/mL,纯度为(97.43±2.96)%,活性为(0.91±0.03)U/mg。经低、中剂量4A1-MGL和3B8-MGL作用48、72 h,高剂量4A1-MGL和3B8-MGL作用24、48、72 h后,GLC细胞的抑制率均显著升高,且高剂量组作用72 h时显著高于同时间点低、中剂量组(P0.05)。结论:本研究成功优化了重组蛋氨酸酶表达的诱导条件,所得4A1-MGL和3B8-MGL可剂量依赖性地抑制GLC细胞增殖。