一种高效细胞永生化载体的构建及其功能分析

作     者：宋子仪 杨浩 高倩 李岳峰 史新娥 庞卫军 杨公社 SONG Zi-Yi;YANG Hao;GAO Qian;LI Yue-Feng;SHI Xin-E;PANG Wei-Jun;YANG Gong-She

作者机构：西北农林科技大学动物科技学院动物脂肪沉积与肌肉发育实验室 

出 版 物：《农业生物技术学报》 (Journal of Agricultural Biotechnology)

年 卷 期：2013年第21卷第8期

页      面：984-992页

核心收录：

学科分类：08[工学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家转基因生物新品种培育重大专项(No.2011ZX08006-005) 国家973计划项目(No.2012CB124705) 

主　　题：细胞永生化 hTERT 慢病毒 猪前体脂肪细胞 

摘      要：细胞永生化在基因功能验证、转基因动物制作、药物研发等领域发挥关键作用,然而由于细胞永生化难度大,所以到目前为止仅有少数种类的细胞被永生化。为了解决这一技术问题,本研究拟通过构建人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的慢病毒表达载体来提高原代细胞永生化效率,从而最终建立细胞系。本研究先用PCR的方法从载体pBABE-neo-hTERT上扩增获得hTERT基因片段,然后将其连接到慢病毒骨架载体pLV-puro上,最终获得目标载体pLV-puro-hTERT。为了验证这一载体的有效性,先将其包装成慢病毒颗粒,再对猪原代前体脂肪细胞进行侵染,然后用嘌呤霉素筛选获得阳性克隆,之后检测了阳性克隆的端粒酶的活性、细胞增殖和分化能力。研究结果表明,与对照组相比,pLV-puro-hTERT慢病毒侵染猪前体脂肪细胞,可使细胞端粒酶mRNA的表达水平上调12倍,并极显著的促进了猪前体脂肪细胞的增殖,同时不影响猪前体脂肪细胞的分化。本研究所构建的慢病毒表达载体能够有效的提高原代细胞的增殖能力,同时保持了原代细胞的生物学特性,这将为进一步永生化原代细胞提供便利。