微小RNA-1在氧化应激下对人小梁网细胞中纤维连接蛋白表达的调节作用

作     者：郭俊宏 苏畅 蒋少云 王芳 封霄 汪建涛 Guo Junhong;Su Chang;Jiang Shaoyun;Wang Fang;Feng Xiao;Wang Jiantao

作者机构：天津医科大学眼科医院天津医科大学眼视光学院天津医科大学眼科研究所300384 北京大学深圳医院口腔医学中心深圳518036 深圳市眼科医院深圳市眼病防治研究所暨南大学附属深圳眼科医院深圳大学眼视光学院518040 

出 版 物：《中华眼科杂志》 (Chinese Journal of Ophthalmology)

年 卷 期：2019年第55卷第5期

页      面：355-360页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(81270994 81070725) 

主　　题：微RNAs 氧化性应激 小梁网 纤连蛋白类 

摘      要：目的探讨氧化应激下微小RNA-1(miR-1)在人小梁网细胞(HTMC)中的表达及其对纤维连接蛋白(FN)的表达调控作用。方法实验研究。分别用0、60、100、200、400μmol/L H2O2对HTMC进行刺激6h;刺激后的细胞在体外培养24h,随后采用实时荧光定量PCR检测各组细胞miR-1和FN的表达情况。根据生物信息学分析预测出miR-1的靶基因为FN;分别构建pcDNA3/pri-miR-1、pcDNA3/增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-FN-3 -非翻译区(3 -UTR)和pcDNA3/EGFP-FN突变体3 -UTR(FN-3 UTRmut)载体并转染HTMC,使用红色荧光蛋白(RFP)表达质粒pDsRed2-N1作为内参,转染48h后检测EGFP和RFP的吸光度,以探究miR-1对FN表达的影响。过表达miR-1载体转染HTMC后用200μmol/L H2O2刺激24h,采用实时荧光定量PCR法、蛋白免疫印迹法和荧光免疫组织化学染色分别检测FN mRNA和蛋白的表达变化。采用单因素方差分析以及两样本t检验对数据进行统计学分析。结果随着H2O2浓度升高,miR-1的水平逐渐下降(F=390.80,P0.01),而FN的水平逐渐升高(F=13.16,P0.01)。与对照(1.000)相比,200μmol/L和400μmol/L H2O2刺激后的HTMC中miR-1水平分别下降至0.608±0.014(t=21.67,P0.01)和0.409±0.020(t=29.91,P0.01),FN的mRNA水平分别上升至1.630±0.233(t=4.47,P=0.011)和1.903±0.246(t=6.15,P=0.003)。通过生物信息学分析,预测到miR-1在FN的mRNA3 -UTR上存在可能的结合位点,双荧光检测发现:pcDNA3/pri-miR-1和pcDNA3/EGFP-FN-3 UTRmut共转染的细胞EGFP表达(0.562±0.018)高于pcDNA3/pri-miR-1和pcDNA3/EGFP-FN-3 UTR共转染细胞(0.329±0.015)(t=17.39,P0.01)。与对照(1.000)相比,过表达miR-1时FN的mRNA表达量下降至0.294±0.081(t=11.01,P0.01);蛋白水平减少至0.584±0.022(t=5.57,P0.01)。结论氧化应激下HTMC中miR-1水平降低,而FN的表达升高;miR-1通过靶定FN的3 -UTR来抑制FN的表达。