小鼠尿激酶型纤溶酶原激活物与其受体结合关键氨基酸的鉴定

作     者：郁婷婷 刘宏景 傅启华 YU Ting-ting;LIU Hong-jing;FU Qi-hua

作者机构：上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心检验科上海200127 上海交通大学医学院附属新华医院检验科 

出 版 物：《血栓与止血学》 (Chinese Journal of Thrombosis and Hemostasis)

年 卷 期：2010年第16卷第6期

页      面：259-263页

学科分类：10[医学] 

基　　金：教育部留学回国人员科研启动基金资助 

主　　题：小鼠 尿激酶型纤溶酶原激活物 受体结合 关键氨基酸 鉴定 Receptor Plasminogen Activator uPAR 突变体 表达质粒 点突变 表面等离子共振技术 重组蛋白 sephadex 阳离子交换层析 细胞表面 分子筛纯化 生物学效应 免疫印迹法 稳定表达 

摘      要：目的尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)在细胞表面介导多种生物学效应。本文目的是解析小鼠uPA蛋白结构中与其受体结合的关键氨基酸。方法包含小鼠uPA全长cDNA的质粒购于ATCC公司,小鼠cDNA序列进一步克隆至Puro-pMT表达载体。用定点突变法构建各类uPA突变体表达质粒。表达质粒用磷酸钙转染至S2细胞中,用10μg/ml嘌呤霉素筛选稳定表达细胞。表达的重组蛋白分别用CM sephadex柱和sephadex G75柱纯化。纯化后的蛋白分别用SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定。用表面等离子共振技术(SPR)检测重组uPA与uPAR的结合常数。结果用定点突变法成功构建小鼠uPA S22、Y23、K24、Y25、F26、S27、I29、R31、E41、S358分别突变为丙氨酸的突变体及R28、30、31突变为N28、H30、W31的突变体M3。经阳离子交换层析和分子筛纯化,重组蛋白的纯度均大于95%并能被小鼠uPA抗体所识别。结合试验表明野生型uPA和M3型uPA的KD值分别为0.467 nM和1.64 nM,10种点突变uPA的KD值范围为0.388 nM至36.5 nM。结论小鼠uPA中至少有7个氨基酸(Y23、K24、Y25、F26、S27、I29、R31)涉及小鼠uPA-uPAR的结合;Y23、Y25和F26是其中的关键氨基酸。