新型Tet-On反式激活因子对GDNF基因腺相关病毒载体表达调控的研究

作     者：陈腾 李新钢 吴承远 冈田尚己 小泽敬也 

作者机构：山东大学齐鲁医院神经外科济南250012 日本自治医科大学分子病态治疗研究中心遗传子治疗研究部 

出 版 物：《中华医学杂志》 (National Medical Journal of China)

年 卷 期：2005年第85卷第6期

页      面：405-408页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主　　题：GDNF基因 强力霉素 表达调控 反式激活因子 体内 阴性 TA 酶切位点 目的基因 腺相关病毒载体 

摘      要：目的 通过在胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因腺相关病毒(AAV)表达载体中插入改良的Tet On调控因子,达到有目的调节GDNF的表达,避免基因过度表达或重组可能对宿主产生的危害。方法 首先在pAAV- GDNFflag前病毒质粒的hHG部分插入寡核苷酸序列,通过含相应酶切位点的引物,聚合酶链反应(PCR)扩增反式激活因子rtTA_2s S_2和四环素反应元件 (TRE),并插入寡核苷酸序列,构建pAAV- rtTA_2s -S_2- TRE -GDNFflag。与辅助质粒共转染HEK293细胞完成重组腺相关病毒(rAAV)载体的包装,氯化铯梯度超速离心分离病毒裂解液,半透膜提纯病毒载体,实时定量PCR(RQ- PCR)检测病毒效价。rAAV感染HEK293细胞,荧光显色和Western印迹法检测rtTA_2s S_2的体外调控;rAAV感染Wistar小鼠腓肠肌,酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测GDNF基因表达的体内调控。结果 体外实验强力霉素阳性组Western印迹可见明显GDNF条带,阴性组未见;体内实验强力霉素阳性组GDNF在 2周内表达 (32 .6pg/ml±2 .6pg/ml),高于强力霉素阴性组 ( 10 .1pg/ml±2 .4pg/ml),差异有统计学意义。结论 Tet -On反式激活因子rtTA_2s S_2、TRE和GDNF基因可构建在同一AAV载体,通过调节诱导剂强力霉素的浓度,rtTA2s -S2在体内和体外均能有效调控下游目的基因GDNF的表达。