兔纤维环细胞复合KLD-12多肽纳米纤维凝胶体外三维培养的实验研究

作     者：梁相辰 孙建华 卞正君 邵辉 黄朝庆 李相晨 于洋 LIANG Xiangchen;SUN Jianhua;BIAN Zhengjun;SHAO Hui;HUANG Zhaoqing;LI Xiangchen;YU Yang

作者机构：石河子大学医学院新疆石河子832008 石河子大学医学院附属第一医院骨三科 

出 版 物：《中国修复重建外科杂志》 (Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery)

年 卷 期：2016年第30卷第3期

页      面：303-308页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 08[工学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 080502[工学-材料学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(81160224,81560363) 兵团博士基金资助项目(2011BB017) 

主　　题：椎间盘退变 组织工程 纤维环细胞 KLD-12多肽 兔 

摘      要：目的探讨兔纤维环细胞复合KLD-12多肽纳米纤维凝胶体外培养的可能性,寻找修复椎间盘退变的理想种子细胞和支架。方法胰蛋白酶消化法提取6月龄新西兰大白兔纤维环细胞,培养至第3代,复合于KLD-12多肽制备KLD-12多肽/纤维环细胞凝胶。倒置显微镜观察凝胶内细胞形态变化;细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖活性;钙黄绿素(Calcein-AM)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光染色观察凝胶内活、死细胞,计算活细胞比率;阿尔新蓝法检测培养基中糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;免疫荧光染色观察Ⅱ型胶原分泌情况;实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)检测纤维环细胞Ⅱ型胶原及蛋白聚糖(Aggrecan)基因表达情况。结果复合于凝胶中的纤维环细胞呈圆形,少部分在凝胶边缘处贴壁的细胞呈多角形。CCK-8结果显示,细胞增殖活性随培养时间延长呈增加趋势,培养14 d活性显著高于其余各时间点(P0.05),且各时间点活性均显著高于空白凝胶对照组(P0.05)。Calcein-AM/PI双荧光染色观察示,培养5、14 d凝胶内细胞活细胞比率分别89.32%±8.58%和97.81%±1.09%,比较差异无统计学意义(t=—1.962,P=0.097)。GAG检测示,细胞中GAG含量随培养时间延长逐渐增加,8 d达峰值,之后逐渐下降;培养5、8、11 d时GAG含量显著高于2、14 d时(P0.05)。免疫荧光染色示细胞中Ⅱ型胶原正常分泌。RT-q PCR检测示,培养5、14 d凝胶内纤维环细胞均可见Ⅱ型胶原和Aggrecan基因表达,14 d时基因相对表达量均显著高于5 d时(P0.05)。结论纤维环细胞能够在KLD-12多肽纳米纤维凝胶中正常生长增殖,主要细胞外基质成分可正常表达,细胞生物活性良好。