人HGF基因重组逆转录病毒表达载体及包装细胞株的构建和鉴定

作     者：王韫芳 南雪 岳文 李艳华 闫舫 裴雪涛 

作者机构：军事医学科学院野战输血研究所北京100850 

出 版 物：《军事医学科学院院刊》 (Bulletin of the Academy of Military Medical Sciences)

年 卷 期：2004年第28卷第3期

页      面：205-208页

核心收录：

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

基　　金：国家重点基础研究发展规划 ("973"计划 )资助项目 ( 2 0 0 1CB5 0 990 6) 国家高技术研究发展计划 ("863"计划 )重大专项( 2 0 0 2AA2 0 5 0 5 1 2 0 0 3AA2 0 5 160 ) 

主　　题：肝细胞生长因子 包装细胞PT67 逆转录病毒载体 FF/HGF细胞株 转染 

摘      要：目的 :构建携带肝细胞生长因子 (HGF)的逆转录病毒载体 ,并建立高效、稳定生产HGF的包装细胞株。方法 :以pcDNA3.0 HGF质粒为模板进行PCR反应扩增出HGF基因全长序列 ,亚克隆至逆转录病毒载体pMSCVneo构建重组逆转录病毒质粒 ,以脂质体介导转染包装细胞PT6 7,经G4 18筛选 ,进而挑选抗性集落扩大培养后 ,用靶细胞NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出高效产毒细胞株。扩大培养后进行RT PCR鉴定HGFmRNA的表达。扩大培养NIH3T3细胞抗性集落 (NIH3T3/HGF) ,并用细胞培养上清进行人肝癌细胞系HepG2的扩散试验。结果 :PCR反应扩增出 2 2 0 0bp的HGF基因 ,构建了重组逆转录病毒表达载体pMSCV HGF ,测序鉴定正确。经脂质体介导转染包装细胞、G4 18筛选和NIH3T3测定病毒滴度 ,筛选出具有最高病毒滴度 (8.8× 10 7cfu /ml)的细胞集落 ,扩大培养后建立高效表达HGF的包装细胞株PT/HGF ,RT PCR证实HGF基因在PT/HGF中有转录。NIH3T3/HGF培养上清可使HepG2细胞扩散 ,形态改变。结论 :成功构建了携带HGF的逆转录病毒载体pMSCV HGF ,并建立了稳定、高效生产有活性的HGF的产毒细胞株PT/HGF。