Gluc-GFP 双标记系统的构建及验证

作     者：张雪松 户义 康晓平 张雨 李裕昌 吴晓燕 杨银辉 Zhang Xuesong;Hu Yi;Kang Xiao ping;Zhang Yu;Li Yuchang;Wu Xiaoyan;Yang Yinhui

作者机构：安徽医科大学合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 

出 版 物：《中华微生物学和免疫学杂志》 (Chinese Journal of Microbiology and Immunology)

年 卷 期：2014年第34卷第11期

页      面：854-858页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主　　题：双标记 Gluc-GFP 分子成像 病毒研究 

摘      要：目的：构建含Gluc-GFP的双标记系统，为研究病毒的体外标记和活体成像提供技术手段。方法根据文献报道合成split-GFP基因，将GFP拆分为G1-10与G11两部分，分别构建含G1-10与G11的pcDNA3．1表达质粒并通过荧光观察验证其相互作用。然后通过融合PCR技术将Gluc基因与G11基因通过Linker连接并插入到pcDNA3．1上，与G1-10表达质粒共转染293T细胞，测定细胞上清中Gluc荧光素酶的活性，并进行GFP荧光观察。为了更方便对病毒进行细胞水平的观测和筛选，利用慢病毒表达系统构建能稳定表达G1-10的MDCK细胞系，再向细胞系中转染G11质粒，通过红色荧光蛋白（ RFP）标记和嘌呤霉素的抗性对细胞系以及GFP活性进行筛选与验证。结果split-GFP基因共转染细胞后的荧光观察结果证实了split-GFP拆分策略的可行性。 Gluc-G11与G1-10质粒共转染后，细胞能够发出明亮的绿色荧光，上清中荧光素的活性也较高。在此基础上，建立的G1-10 MDCK细胞系能够稳定表达出G1-10，用G11质粒转染该细胞系后，可检测到GFP荧光。结论成功构建了含Gluc-GFP的双标记系统，split-GFP拆分策略可行，Gluc-G11不会影响荧光素酶Gluc的生理活性；G1-10细胞系的稳定表达可简化双标记系统的制备，为在细胞和活体水平研究病毒致病机制提供技术手段。