小鼠DUSP13＇-UTR双荧光素酶报告基因表达系统的建立及功能鉴定

作     者：温晓梨 孙宏卫 欧小利 王妮 梅柱中 姜勇 

作者机构：广州南方医科大学病理生理教研室、广东省蛋白质组学重点实验室510515 

出 版 物：《解放军医学杂志》 (Medical Journal of Chinese People's Liberation Army)

年 卷 期：2013年第38卷第4期

页      面：265-268页

核心收录：

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(81070955 81030055)~~ 

主　　题：荧光素酶类 基因 报告 转录 遗传 

摘      要：目的建立小鼠双特异性磷酸酶1(DUSP1)3 端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因表达系统,并对其进行功能鉴定。方法提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板通过PCR扩增获得小鼠DUSP1 3 -UTR全长序列,酶切后克隆至pGL3-control载体荧光素酶编码基因的下游,获得重组载体LuDP,经PCR、限制性内切酶酶切、DNA序列分析鉴定正确后与内参照质粒pRL-TK共转染NIH3T3细胞,48h后检测双荧光素酶报告基因的表达。将含有小鼠DUSP1 3 -UTR的荧光素酶表达模块与来源于pRL-TK质粒的RL表达模块克隆至pLenti6-TR质粒中,获得双荧光素酶报告基因表达载体LuDP/RL,将其与RNA结合蛋白HuR表达载体(pcDNA3.1-HuR-FLAG)、mmu-miR-101a分别共转染NIH3T3细胞,检测双荧光素酶的活性,分析HuR、mmu-miR-101对荧光素酶基因表达活性的影响。结果成功构建了双荧光素酶报告基因表达载体。小鼠DUSP1 mRNA 3 -UTR可显著下调与其相连的荧光素酶的表达活性(0.14±0.01倍,P0.01);共转染HuR可上调荧光素酶的表达活性(1.40±0.20倍,P0.05),共转染mmu-miR-101a则可下调荧光素酶表达活性(0.57±0.18倍,P0.05)。结论成功构建了DUSP1 3 -UTR双荧光素酶报告基因表达系统,该系统可用于转录后调控元件对小鼠DUSP1基因表达的调控机制研究。