细菌内同源重组法高效制备携带增强型绿色荧光蛋白与人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组腺病毒载体

作     者：谭艳 王家宁 郭凌郧 孔霞 唐俊明 张少峰 黄永章 罗超 TAN Yan;WANG Jia-ning;GUO Ling-yun;KONG Xia;TANG Jun-ming;ZHANG Shao-feng;HUANG Yong-zhang;LUO Chao

作者机构：郧阳医学院附属人民医院泌尿外科研究所湖北十堰442000 郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所湖北十堰442000 郧阳医学院基础医学研究所湖北十堰442000 

出 版 物：《郧阳医学院学报》 (Journal of Yunyang Medical College)

年 卷 期：2007年第26卷第2期

页      面：65-70页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金(No:30600614) 教育部重点项目(No:207072) 湖北省自然科学基金(No:2006ABA342) 教育厅中青年项目(No:Q200624003) 

主　　题：同源重组 人内皮型一氧化氮合酶 基因治疗 腺病毒 绿色荧光蛋白 

摘      要：目的:利用细菌内同源重组法快速构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人内皮型一氧化氮合酶(he-NOS)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达EGFP和heNOS的重组腺病毒。方法:质粒载体pHCMV SP1A-heNOS用EcoRⅠ酶切,回收heNOS cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pShuttle-heNOS-EGFP;然后用PmeI线性化后的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP,纯化,鉴定,滴度测定。结果:heNOS cDNA成功地插入到穿梭质粒中,pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组腺病毒经PCR检测表明携带有目的基因heNOS,滴度约为6.5×1015pfu/L。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP为勃起功能障碍的基因治疗奠定了基础,携带的EGFP标记基因可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。