miRNA138体外抑制C2C12细胞纤维化研究

作     者：薛鸣丰 龚遂良 戴加平 陈刚 胡隽宇 XUE Ming-feng;GONG Sui-liang;Dai Jia-ping;CHEN Gang;HU Jun-yu

作者机构：嘉兴市第二医院骨科嘉兴314000 

出 版 物：《上海交通大学学报（医学版）》 (Journal of Shanghai Jiao tong University:Medical Science)

年 卷 期：2015年第35卷第1期

页      面：51-58页

核心收录：

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

基　　金：嘉兴市科技局科技计划项目(2012AY1071-7)~~ 

主　　题：Smad4 纤维化 miRNA138 C2C12 

摘      要：目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导小鼠成肌细胞C2C12建立体外纤维化模型,观察miRNA138含量改变对细胞纤维化指标的影响,分析miRNA138对细胞纤维化的影响是否通过其靶基因Smad4实现。方法设计并合成miRNA138-mimics、miRNA138-inhibitor、miRNA138-NC,经脂质体转染至C2C12细胞,转染后细胞再经TGF-β1(10 ng/m L)诱导48 h;Real-time PCR检测胞内miRNA138表达,Western blotting检测胞内纤维化相关蛋白Smad4、vimentin、α-SMA及collagenⅠ表达变化,确认纤维化模型是否成功建立并分析胞内miRNA138表达改变对细胞纤维化指标的影响;CCK-8法检测miRNA138表达改变对纤维化过程中C2C12细胞增殖活性的影响;生物信息学分析miRNA138与Smad4理论结合位点并通过荧光素酶报告基因实验进行验证;构建Smad4基因表达载体,并与miRNA138-mimics共转染C2C12细胞,转染后细胞再经TGF-β1诱导发生纤维化,Western blotting检测细胞纤维化相关蛋白变化,分析外源Smad4表达对于miRNA138抑制细胞纤维化作用的影响。结果 miRNA138-mimics转染C2C12细胞后细胞内miRNA138表达明显上升;miRNA138-inhibitor转染后,C2C12细胞内miRNA138表达下降;转染对照组细胞内miRNA138表达无明显变化;蛋白检测结果显示:TGF-β1诱导C2C12细胞48 h,胞内Smad4、vimentin、α-SMA和collagenⅠ蛋白表达均明显升高,细胞对数生长期增殖活性明显增强,表明细胞纤维化模型成功建立;细胞内miRNA138过表达明显抑制了C2C12细胞纤维化;荧光素酶活性检测数据显示,miRNA138与Smad4的预测靶位是客观存在的;在C2C12细胞内高表达外源Smad4基因,可明显减弱miRNA138-mimics对细胞纤维化相关蛋白的抑制作用。结论 miRNA138可以抑制TGF-β1诱导的C2C12细胞纤维化,是通过抑制其靶蛋白Smad4表达实现的。