利用人天然Fab段抗体库从肾细胞癌中筛选抗gp96抗体

作     者：马小兵 畅继武 李慧忠 李成文 

作者机构：华北煤炭医学院病理教研室 天津医科大学第二医院天津市泌尿外科研究所 

出 版 物：《现代预防医学》 (Modern Preventive Medicine)

年 卷 期：2010年第37卷第18期

页      面：3511-3513页

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

基　　金：天津市自然科学基金资助项目(043608411) 

主　　题：噬菌体抗体库 抗体Fab段 gp96 肾细胞癌 

摘      要：[目的]构建人天然Fab段抗体库,并用从肾细胞癌组织中提取纯化的gp96,并以此来筛选抗gp96特异性抗体,为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法。[方法]取健康新鲜血液50ml,分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,设计多对引物,以PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA。轻链PCR产物和噬粒载体pComb3经SacⅠ和XbaⅠ酶切,由T4DNA连接酶连接,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,扩增后提取噬粒,构建轻链库。轻链库和重链Fd段PCR产物经XhoⅠ和SpeⅠ酶切,以同样方法连接后转化XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13,产生噬菌体抗体全库。提取噬粒酶切鉴定轻链库和全库有无插入片段。分别以噬菌体全库和提取的噬粒为模板,以轻、重链不同引物组合进行PCR扩增。应用亲和层析和离子交换层析从肾细胞癌组织中提取纯化gp96,并以此为抗原对构建的抗体库进行3轮筛选。[结果]提取的淋巴细胞总RNA及逆转录合成的cDNA质量好,部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增。Fab库容为1.2×106,酶切和PCR显示有插入片段。用从肾细胞癌组织中提取出的gp96进行3轮筛选,抗体库得到71.5倍的富集。[结论]本研究构建的人天然Fab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体,用于免疫治疗打下基础。