高通量测序方法在重症肺炎病原体检测的应用

作     者：刘孝荣 马东礼 姜含芳 陈虹宇 蔡德丰 朱纯青 郑跃杰 粟东芳 杨振宇 刘艳红 Liu Xiaorong;Ma Dongli;Jiang Hanfang;Chen Hongyu;Cai Defeng;Zhu Chunqing;Zheng Yuejie;Li Dongfang;Yang Zhenyu;Liu Yanhong

作者机构：深圳市儿童医院深圳病原体高通量基因测序技术工程实验室518038 深圳微健康基因科技有限公司 

出 版 物：《中华检验医学杂志》 (Chinese Journal of Laboratory Medicine)

年 卷 期：2017年第40卷第8期

页      面：609-613页

核心收录：

学科分类：100208[医学-临床检验诊断学] 1002[医学-临床医学] 100202[医学-儿科学] 10[医学] 

基　　金：深圳市未来产业发展专项资金(深发改(2014)1712号) 

主　　题：高通量核苷酸序列分析 肺炎 肺炎支原体 

摘      要：目的 建立高通量测序技术检测重症肺炎病原体的流程和方法,并评估其可行性.方法 临床对照研究. 收集2015年3月至2016年12月深圳儿童医院就诊的76例重症肺炎的患者（实验组）和18例气管软化并排除细菌感染的患者（对照组）,采集肺泡灌洗液标本,同时进行临床检测和高通量测序,并对高通量测序的结果采用PCR方法进行确认,然后对基于高通量测序的重症肺炎病原体检测方法进行评估.采用χ2检验对高通量测序组和非高通量测序组的检出率进行相关性分析.结果 建立了基于高通量测序的重症肺炎病原体的检测流程及方法,该流程包括：标本收集、DNA提取、文库构建、上机测序及生物信息学分析.在76例重症肺炎患者中,66例患者的肺泡灌洗液标本的高通量测序结果为阳性,灵敏度86.84%,显著高于传统临床检验所用的细菌培养、免疫荧光法和定量PCR 3种方法综合检测的灵敏度（68.42%,52/76,χ^2=7.426,P〈0.001）.66份高通量测序阳性标本中,共检测到13种病原体,其中主要的病原体包括肺炎支原体、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和腺病毒等,非高通量测序法共检测到9种病原体.比较临床检验和高通量测序结果,在76份实验组标本中,发现61份（80.26%）标本两者结果完全一致,15份（19.74%）标本结果不完全一致,这些不一致检出的标本主要集中在高通量测序检测出腺病毒、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌而临床培养和免疫荧光方法不能检出这些病原体.PCR验证结果显示高通量检测结果与PCR的检测结果差异没有统计学意义（χ^2=0.517,P=0.472）,高通量检测结果与培养及免疫荧光方法检测结果差异有统计学意义（χ^2=11.671,P＆lt;0.001）.结论 基于高通量测序的重症肺炎病原体的检测方法灵敏度高,能检测出未知病原体,优于传统临床检验所用方法.