基于甲基化反应系统检测SETD3甲基化组蛋白的位点

作     者：钟玙沄 黄梦怡 孙江 黄穗 李月 罗海华 姜勇 刘靖华 Yuyun Zhong;Mengyi Huang;Jiang Sun;Sui Huang;Yue Li;Haihua Luo;Yong Jiang;Jinghua Liu

作者机构：广东省功能蛋白质组学重点实验室南方医科大学基础医学院病理生理学教研室广东广州510515 

出 版 物：《生物技术》 (Biotechnology)

年 卷 期：2017年第27卷第3期

页      面：245-251页

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

基　　金：国家自然科学基金项目(“甲基化转移酶SETD4调控炎症因子释放的分子机制研究”,No.81471901) 广东省自然科学基金重点项目(“甲基化转移酶SETD4在内毒素休克中的作用探讨”,No.2015A030311031) 

主　　题：GST-SETD3 重组蛋白原核表达 蛋白纯化 甲基化反应 甲基转移酶 

摘      要：[目的]构建pEGX-4T-1-Setd3,表达并纯化GST-SETD3蛋白;用获得的蛋白进行体外甲基化反应并鉴定其活性,建立体外甲基化反应系统。[方法]PCR扩增小鼠全长Setd3,插入到pEGX-4T-1载体获得pEGX-4T-1-Setd3质粒。将质粒转化大肠杆菌,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-SETD3蛋白并进行纯化。将获得的GST-SETD3蛋白定量后进行体外组蛋白甲基化反应,用Western Blot检测GST-SETD3对组蛋白H3K4及H3K36的甲基化情况。[结果]p GEX-4T-1-Setd3质粒构建正确,纯化的GST-SETD3蛋白纯度较高;甲基化反应结果表明,用不同来源的组蛋白、反应时间、反应缓冲液及检测方法均检测不到GST-SETD3二甲基化H3K4;GSTSETD3可以二甲基化H3K36。[结论]成功表达和纯化GST-SETD3蛋白;该蛋白可以使H3K36发生二甲基化,但不能使H3K4二甲基化。成功构建体外甲基化反应系统。