核转运蛋白2慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

作     者：卫定禄 高方 吕智 

作者机构：山西医科大学第二临床医学院太原030001 

出 版 物：《中华临床医师杂志（电子版）》 (Chinese Journal of Clinicians(Electronic Edition))

年 卷 期：2017年第11卷第9期

页      面：1536-1539页

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：山西省重点研发计划项目(201603D321051) 

主　　题：核转运蛋白2 慢病毒载体 RNA干扰 重组质粒 

摘      要：目的探索构建针对人类核转运蛋白2(KPNA2)基因的重组慢病毒干扰RNA(sh RNA)载体的方法,研究其对人骨肉瘤细胞株MG63的沉默效率。方法针对KPNA2基因设计小片段干扰序列。加入AgeⅠ酶和Eco RⅠ酶酶切位点,根据设计好的序列合成单链DNA oligo并退火合成双链DNA oligo。将合成好的双链DNA oligo与GV115载体重组,形成GV115-sh RNA慢病毒载体。聚合酶链式反应(PCR)法鉴定筛选出阳性重组子,经测序后包装慢病毒载体。荧光法测定病毒滴度,重组慢病毒感染骨肉瘤细胞株MG63,通过显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达来计算其转染效率。RT-PCR法检测重组慢病毒RNA干扰载体对人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2表达的沉默效率。实验结果数据以均数±标准差(sx±)表示,应用SPSS 13.0统计软件分析,两组均数间的比较采用t检验,以P0.05为差异有统计意义。结果经PCR分析和测序证实,成功构建KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体;荧光法测定病毒滴度为4×108 TU/ml;荧光显微镜下观察GFP,显示细胞感染效率达到80%以上;RT-PCR检测对照组及实验组KPNA2 m RNA表达分别为0.991±0.087 vs.0.216±0.012,差异有统计学意义(P0.01)。结论 KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体构建成功,并有效干扰人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2 m RNA的表达。