一种高效制备人乳酸脱氢酶LDH_5参考物质的方法及应用

作     者：刘赪阳 王玉梅 黄薇 王萌 张恩毅 郭健 肖飞 Chengyang Liu;Yumei Wang;Wei Huang;Meng Wang;Enyi Zhang;Jian Guo;Fei Xiao

作者机构：北京大学第五临床医学院北京医院国家老年医学中心老年医学重点实验室北京100730 中国食品药品检定研究院体外诊断试剂室卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050 北京医院检验科北京100730 

出 版 物：《生物技术》 (Biotechnology)

年 卷 期：2017年第27卷第2期

页      面：174-179页

学科分类：08[工学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金项目(“cGMP信号通路对血管重构的分子调控机制研究”,No.81571384 “cGMP与Tropomyosin相互作用在肺动脉高压发生发展中的作用机制研究”,No.81400036) 

主　　题：乳酸脱氢酶 基因重组 密码子 参考物质 

摘      要：[目的]研究高效、廉价制备人乳酸脱氢酶LDH5参考物质的方法。[方法]选取人乳酸脱氢酶基因(LDHA)CDS序列进行分析及优化,合成优化后的基因,克隆至表达载体pRSF-Duet中构建重组乳酸脱氢酶LDH5表达载体。使用大肠杆菌*** BL21(DE3)菌株对目的基因进行表达,异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导,镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定酶纯度,BCA法分析酶浓度,全自动生化仪分析酶活性、稳定性。[结果]经优化后的LDHA基因的大肠杆菌密码子适应指数为1;纯化蛋白达到电泳纯,比活性达19.01 U/mg,在4℃及25℃可稳定保存8 d。[结论]重组乳酸脱氢酶的表达效率为100 mg/L,酶活性、稳定性、纯度达到临床生化检测的参考物质的条件,可以作为血清乳酸脱氢酶检测的标准物质。