基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的RIP1稳定敲除细胞模型的构建及功能研究

作     者：陈瑶 刘青 邢微微 陈惠华 张冬冬 王园园 邹民吉 徐东刚 刘中成 CHEN Yao LIU Qing XING Wei-wei CHEN Hui-hua ZHANG Dong-dong WANG Yuan-yuan ZOU Min-ji XU Dong-gang LIU Zhong-cheng[1.]

作者机构：河北大学药学院河北保定071002 军事医学科学院基础医学研究所基因组工程研究室北京100850 河北大学生命科学学院河北保定071002 

出 版 物：《军事医学》 (Military Medical Sciences)

年 卷 期：2017年第41卷第2期

页      面：96-100,105页

学科分类：0710[理学-生物学] 1002[医学-临床医学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 100206[医学-皮肤病与性病学] 10[医学] 

基　　金：国家科技重大专项"重大新药创制"资助项目(2012ZX09102301-017) 河北省研究生创新资助项目(S2016020) 河北省自然科学基金资助项目(H2013201128 H2016201121) 

主　　题：CRISPR/Cas9系统 基因敲除 受体相互作用丝/苏氨酸蛋白激酶1 HaCaT细胞 凋亡 细胞增殖 

摘      要：目的利用CRISPR/Cas9技术构建RIP1稳定敲除的人永生化表皮细胞HaCaT细胞株,在此基础上对RIP1功能进行探究。方法针对GenBank中RIP1基因序列,设计靶向RIP1不同外显子的小指导RNA(sgRNA),并将其克隆至SpCas9-2A-Puro V2.0(PX459)载体中,获得PX459-sgRNA基因敲除载体。将上述载体转染HaCaT细胞并通过嘌罗霉素筛选获得阳性克隆,免疫印迹和DNA测序技术进一步鉴定RIP1敲除效果最佳的单克隆。通过CCK-8实验检测RIP1缺失对细胞增殖能力的影响。分别用TNF-α处理HaCaT^(WT)细胞和HaCaT^(R1P1KO)细胞,流式细胞仪检测敲除RIP1对TNF-α诱导细胞死亡的影响,进一步通过胱天蛋白酶(caspase)抑制剂Z-VAD-FMK判断细胞死亡类型。结果与结论利用CRISPR/Cas9系统成功构建RIP1完全敲除的细胞模型,功能分析发现敲除RIP1导致细胞增殖能力减慢;HaCaT^(R1P1KO)对TNF-α诱导的死亡畀常敏感,这种死亡能被Z-VAD-FMK显著抑制,证明为caspase依赖性细胞凋亡。该研究为探究RIP1在皮肤损伤中的作用奠定了基础。