曲霉菌内切型壳聚糖酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

作     者：卢华定 连礼熠 陈明伟 戴驭虎 Lu Hua-ding;Lian Li-yi;Chen Ming-wei;Dai Yu-hu

作者机构：中山大学附属第三医院骨科广东省广州市510630 

出 版 物：《中国组织工程研究》 (Chinese Journal of Tissue Engineering Research)

年 卷 期：2014年第18卷第34期

页      面：5490-5496页

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 08[工学] 0836[工学-生物工程] 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(82172040) 广东省自然科学基金资助项目(S2011010004808 S2013010016385) 广东省科技计划基金资助项目(2012B031800451)~~ 

主　　题：生物材料 材料相容性 壳聚糖 壳聚糖酶基因 克隆 表达 酶活性 国家自然科学基金 

摘      要：背景:壳聚糖酶是高效、特异降解壳聚糖的酶,因此高效稳定地表达具有较高活性的壳聚糖酶可有效提高壳聚糖介导的基因治疗效果。目的:构建一种可高效降解壳聚糖的壳聚糖酶基因,探讨其在大肠杆菌中的表达及影响其活性的主要因素。方法:根据GenBank公布的曲霉菌CJ22-326内切型壳聚糖酶基因序列信息(EU302818),设计并合成23条重叠引物,PCR法扩增壳聚糖酶基因片段,构建原核表达质粒pET28a-His6-CSN,将其转化大肠杆菌,收集融合蛋白His6-CSN,检测融合蛋白的表达及酶活性,同时检测不同pH值及温度对壳聚糖酶活性的影响。结果与结论:Western-blot证实融合蛋白His6-CSN成功表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示表达的融合蛋白相对分子质量约为29 000,二硝基水杨酸比色法测定壳聚糖酶对壳聚糖的降解活性显著高于溶菌酶(P0.05),但低于灰色链霉菌壳聚糖酶(P0.05)。壳聚糖酶的最适pH值和最适温度分别为6.0和50℃,当pH值在4.0-7.0、温度在30-50℃范围内具有较高的酶活性。