人类细胞外囊泡的产量优化与应用

作     者：王晨蕾 程临钊 刘森泉 

作者机构：中国科学技术大学生命科学与医学部 

出 版 物：《中国生物工程杂志》 (China Biotechnology)

年 卷 期：2024年第44卷第9期

页      面：1-13页

核心收录：

学科分类：08[工学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金(82250710171、82100243)资助项目 

主　　题：细胞外囊泡 CD9 CD81 Wnt3a 

摘      要：目的：构建与优化细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)的高产平台，验证此平台是否适用于功能蛋白的装载与递送。方法：通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、流式细胞术或Western blot(WB)检测细胞目的基因表达，采用差速超速离心法浓缩EVs,分别利用WB与纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)检测EVs标记蛋白表达、粒径分布与产量。利用脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导的A549细胞损伤模型验证EVs递送功能蛋白的能力。通过CCK8检测细胞活力，通过Annexin V检测细胞凋亡，利用qRT-PCR检测Wnt/β-catenin下游基因AXIN2、TCF4、NKD1的表达。结果：流式细胞术结果表明CD9、CD81均能在HEK293T和HEK293F上过表达，NTA检测显示CD9更有助于EVs产量的提高。实现在贴壁细胞体系中EVs产量提升4倍，在悬浮细胞体系中EVs产量提升6倍。之后验证高产平台是否适用于功能蛋白Wnt3a的装载与递送。WB结果证实此高产平台能装载Wnt3a蛋白，NTA检测表明此高产平台在装载Wnt3a的同时将EVs产量提升3倍左右。CCK8、Annexin V结果显示CD9 Wnt3a EVs能明显提高A549细胞在LPS诱导损伤后的细胞活力，抑制细胞凋亡。机制上，qRT-PCR表明CD9 Wnt3a EVs激活了Wnt/β-catenin下游基因AXIN2、TCF4、NKD1的表达。结论：构建了一种基于CD9过表达的EVs高产平台，该平台对EVs产量的提升在贴壁细胞与悬浮细胞中均得到了验证，该平台对功能蛋白Wnt3a的递送能力在LPS诱导的A549细胞损伤模型中得到了验证。该平台为实现EVs量产提供了新策略，有望成为一种新的功能蛋白递送平台，在生物学研究和无细胞治疗领域开拓更多应用。