非接触共培养条件下人BMSCs对氧化应激环境中退变髓核细胞凋亡的保护研究

作     者：王锋 吴小涛 王运涛 李果 张明 

作者机构：东南大学附属中大医院骨科南京210009 

出 版 物：《中国修复重建外科杂志》 (Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery)

年 卷 期：2010年第24卷第4期

页      面：391-398页

核心收录：

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 08[工学] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 10[医学] 

基　　金：江苏省自然科学基金资助项目(BK2007107) 东南大学国家自然科学基金预研项目(XJ2008342)~~ 

主　　题：BMSCs 髓核细胞 共培养 椎间盘退变 细胞凋亡 氧化应激 

摘      要：目的BMSCs移植可修复椎间盘退变,但确切修复机制尚不明确。探讨非接触共培养条件下人BMSCs对氧化应激诱导退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)凋亡的保护作用,了解BMSCs移植修复椎间盘退变的可能机制。方法密度梯度离心联合贴壁法分离、培养正常人BMSCs,并鉴定CD34、CD45、CD13细胞表面分子。胶原酶消化法分离、培养人退变椎间盘NPCs,HE染色、倒置相差显微镜观察NPCs细胞形态,甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色鉴定NPCs的类软骨细胞表型。取第3代BMSCs和第1代NPCs按共培养体系不同分为4组:A组单纯NPC(s1×106个)培养,不行凋亡诱导;B组BMSCs(1×106个)与NPCs(1×106个)共培养;C组BMSCs(3×105个)与NPCs(1×106个)共培养;D组单纯NPCs(1×106个)培养,行凋亡诱导。B、C、D组分别于共培养3、7d加入0.1mmolH2O2作用20min诱导NPCs凋亡。胰蛋白酶消化收集各组NPCs,行DAPI染色观察细胞核形态,Annexin-V/碘化丙啶染色、流式细胞仪计算凋亡率,半定量RT-PCR检测Bcl-2、Bax基因转录水平,Western-blot检测Caspase-3蛋白含量。结果成功分离并培养人BMSCs和人退变椎间盘NPCs;BMSCs鉴定呈CD34-、CD45-、CD13+;第1代NPCs呈梭形或多角形,于胞质内表达Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖。DAPI染色示凋亡的NPCs可见细胞核固缩;共培养3、7d后,B组(29.26%±8.90%,18.03%±2.25%)及C组(37.10%±3.28%,13.93%±1.25%)细胞凋亡率均低于D组(54.90%±5.97%,26.97%±3.10%),高于A组(15.67%±1.74%,8.87%±0.15%),比较差异均有统计学意义(P0.05);Western blot检测示B、C组NPCs的Cas-pase-3蛋白表达量低于D组,高于A组,差异有统计学意义(P0.05)。结论非接触共培养条件下人BMSCs可一定程度保护氧化应激诱导的退变NPCs凋亡,BMSCs共培养预处理的NPCs可能通过降低Bax/Bcl-2的转录比例来增强抗凋亡能力。