猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

作     者：赵梓桥 张昆丽 张春红 翟少伦 康欣桐 黄淑坚 张建峰 ZHAO Zi-qiao;ZHANG Kun-li;ZHANG Chun-hong;ZHAI Shao-lun;KANG Xin-tong;HUANG Shu-jian;ZHANG Jian-feng

作者机构：佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528225 广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/广东省动物疫病野外科学观测研究站广东广州510640 

出 版 物：《南方农业学报》 (Journal of Southern Agriculture)

年 卷 期：2024年第55卷第6期

页      面：1798-1806页

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：国家重点研发计划项目(2022YFD1800801-02) 广东省自然科学基金面上项目(2023A1515012153) 科技创新战略专项(高水平农科院建设)—人才项目(R2019YJ-YB2005,R2023PY-QY013) 

主　　题：猪德尔塔冠状病毒(PDCoV) N蛋白 原核表达 多克隆抗体 

摘      要：【目的】构建猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)核衣壳(N)蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体,为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】提取PDCoV HeN17株RNA,经RT-PCR扩增,将N基因克隆至pGEX-6P-1载体构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行IPTG诱导表达。利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白,采用3C蛋白酶去除标签。以纯化后的N蛋白为免疫原免疫3月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价,并通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫沉淀(IP)试验对其进行鉴定。【结果】成功构建原核表达载体pGEX-6p-1-PDCoV-N,获得的PDCoV-N-GST重组蛋白主要以可溶性形式表达,大小约69 kD,经去除GST标签可获得单一目的蛋白条带,经测定蛋白浓度为12.6 mg/mL,获得的PDCoV-N蛋白能与PDCoV阳性血清反应产生单一特异性条带。制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价达1∶4096000,可特异性识别pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的Flag-N蛋白和PDCoV感染LLC-PK1细胞中表达的PDCoV-N蛋白,且能检测到PDCoV-N真核表达载体pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的PDCoV-N蛋白。【结论】成功构建高效PDCoV-N原核表达系统,获得纯度好、浓度高且免疫原性佳的PDCoV-N蛋白,制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价高,具有较强亲和力和特异性,可用于Western blotting、IFA和IP检测。