ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

作     者：代鹏钰 杨蕊 章婷婷 马昕芸 刘会玲 DAI Pengyu;YANG Rui;ZHANG Tingting;MA Xinyun;LIU Huiling

作者机构：甘肃中医药大学第一临床医学院妇科二甘肃兰州730000 甘肃中医药大学甘肃省人民医院妇科二甘肃兰州730000 

出 版 物：《中国肿瘤生物治疗杂志》 (Chinese Journal of Cancer Biotherapy)

年 卷 期：2024年第31卷第7期

页      面：669-674页

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 1002[医学-临床医学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(No.82260557) 

主　　题：α-烯醇化酶 昆虫杆状病毒表达系统 蛋白表达 酶活性位点缺失 

摘      要：目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1。分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3。通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2000 bp的基因片段,与预期大小相符。昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52000,与预期相符。WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应。结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件。