多花黄精查尔酮合酶PcCHS的原核表达、亚细胞定位及表达分析

作     者：潘萍萍 徐志浩 张怡雯 李青 王忠华 PAN Ping-ping;XU Zhi-hao;ZHANG Yi-wen;LI Qing;WANG Zhong-hua

作者机构：浙江万里学院宁波315100 

出 版 物：《生物技术通报》 (Biotechnology Bulletin)

年 卷 期：2024年第40卷第5期

页      面：280-289页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 10[医学] 

基　　金：浙江省生物工程一流学科学生创新项目(CX2022018) 浙江省中药材新品种选育重大科技专项(2021C02074) 浙江省一流学科开放基金项目(KF2021009) 

主　　题：多花黄精 查尔酮合酶基因(CHS) 原核表达 瞬时超表达 蛋白纯化 体外酶活 亚细胞定位 

摘      要：【目的】探究查尔酮合酶(chalcone synthase,PcCHS)基因在多花黄精类黄酮合成中的作用,为后续解析PcCHS功能以及多花黄精新品种选育提供可靠的理论依据。【方法】以多花黄精为cDNA模板,克隆多花黄精PcCHS基因的编码序列,对该基因进行生物信息学分析。通过构建PcCHS的原核表达载体,纯化目的重组蛋白,验证该酶的体外表达活性。利用瞬时超表达体系探究该基因过表达后总黄酮的含量变化。利用Gateway技术构建亚细胞定位载体35S::PcCHS-GFP,通过本氏烟草表达系统确定目的蛋白亚细胞定位情况。【结果】PcCHS基因的开放阅读框为1 251 bp,理论分子量为44.63 kD,等电点为5.89,属于亲水蛋白,与石刁柏(Asparagus officinalis)CHS亲缘关系较近。原核表达实验表明,pET28a-PcCHS经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达可溶性重组蛋白,Western-blot显示大小约为45 kD,与预期大小一致,且纯化的目的蛋白具有一定的酶活性,能催化对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A转化为柚皮素查尔酮。此外,PcCHS瞬时超表达中,PcCHS组的表达量显著高于空载K组,总黄酮含量也显著高于空载K组,最高可达1.83倍。亚细胞定位结果显示,该基因在细胞膜和细胞核中发挥作用。【结论】PcCHS基因原核表达的酶具有体外酶活性,其亚细胞定位于细胞膜和细胞核,且瞬时超表达能够显著提高多花黄精叶片总黄酮含量。