猪丹毒丝菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

作     者：陈超 高春阳 刘刚 姜志康 柳宇 张雪莲 袁生 韩先杰 CHEN Chao;GAO Chunyang;LIU Gang;JIANG Zhikang;LIU Yu;ZHANG Xuelian;YUAN Sheng;HAN Xianjie

作者机构：青岛农业大学动物医学院山东青岛266109 华中农业大学动物科学技术学院、动物医学院湖北武汉430070 佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528225 

出 版 物：《中国兽医科学》 (Chinese Veterinary Science)

年 卷 期：2024年第54卷第3期

页      面：337-343页

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：山东省生猪产业技术体系项目(SDAIT-08-09) 山东省重大科技创新工程项目(2019JZZY010720) 

主　　题：猪丹毒丝菌 grol基因 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 检测方法 

摘      要：为建立一种快速、 敏感的猪丹毒丝菌检测方法, 本试验将猪丹毒丝菌的 grol 基因与载体TA/ Blunt- Zero 相结合构建重组质粒,以该重组质粒 DNA 为模板,筛选最佳反应条件,建 立 SYBR Green Ⅰ荧光定量 PCR 检测方法,并对该方法进行灵敏度、特异性和重复性测定。 结果表明,本研究建立的检测方法对在 2×10^(2)~2×10^(9)copies/ μL 浓度范围内的质粒标准品有良好的线性关系, 线性相关系数 R^(2)=0.999 5,标准曲线为 y=-3.231x+41.834,未见非特异性扩增。 该方法对质粒标准品最低检测浓度为 20 copies/ μL,敏感度比普通 PCR 提高了 1 000 倍。 用该方法检测猪支气管败血波氏杆菌(Bb)、猪链球菌 3 型(Ss3)、猪链球菌 2型(Ss2)、大肠杆菌(***)、沙门菌(Salmonella)和多杀性巴氏杆菌(Pm)时,检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。重复试验结果显示,组内和组间的变异系数均小于 2%,表明该方法具有良好的重复性。运用本试验建立的方法对 20 株疑似猪丹毒丝菌临床样品进行检测,阳性检出率为 60%,高于普通 PCR 检出率(50%)。 综上,本试验建立的检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,适合临床上快速诊断丹毒丝菌。