索诺拉沙漠芽孢杆菌s262过氧化氢酶的异源表达及酶学性质

作     者：吴甜甜 李晓亚 王洪玲 葛文沛 刘娜 WU Tiantian;LI Xiaoya;WANG Hongling;GE Wenpei;LIU Na

作者机构：河南工业大学生物工程学院河南郑州450001 

出 版 物：《微生物学通报》 (Microbiology China)

年 卷 期：2024年第51卷第3期

页      面：769-778页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：2022年度许昌学院“揭榜挂帅”项目(2022JBGS10) 2022年河南工业大学研究生教育改革与质量提升工程项目(HAUTYJS2022JD02) 河南省重大科技专项(231100110300) 

主　　题：过氧化氢酶 异源表达 酶学特性 

摘      要：【背景】索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)s262所产过氧化氢酶具有降解黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)的能力。【目的】在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)s262过氧化氢酶,对表达条件进行优化并测定酶学性质。【方法】将过氧化氢酶基因katA连接到pET28a(+)载体中,构建重组表达质粒pET28a-katA,转化至Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中,通过优化IPTG浓度、诱导温度和诱导时间确定重组酶的最佳表达条件。使用Ni-NTA SefinoseTM Resin分离纯化过氧化氢酶。通过测定过氧化氢酶最适反应温度及热稳定性、最适pH及pH稳定性和金属离子对酶活力的影响对重组酶酶学性质进行分析,通过双倒数作图法对重组酶进行动力学分析。高效液相色谱法检测重组过氧化氢酶对AFB1的降解率。【结果】重组表达质粒pET28a-katA经双酶切(BamHⅠ和HindⅢ)及测序证明构建成功。纯化的重组酶分子量大小在55 kDa,在***中的最佳表达条件为:IPTG浓度0.8 mmol/L,诱导温度25℃,诱导时间10 h。酶最适催化温度50℃,最适pH 7.0时,其动力学参数Vmax为(760.17±19.61)mmol/(min·L),Km为(63.73±3.87)mmol/L。0.1 mmol/L Fe2+、Zn2+和Cu2+对酶有促进作用,酶活分别提高40%、8%和12%,但该浓度下K+对酶起抑制作用,使酶活降低39%。重组酶对AFB1的降解率为61.44%。【结论】成功表达并纯化了索诺拉沙漠芽孢杆菌源过氧化氢酶,为过氧化氢酶的工业生产及应用奠定了基础。