适用于RPA-LFD技术检测对虾肝胰腺DNA样品的快速制备试剂研究

作     者：姚梦丽 白昌明 王崇明 辛鲁生 

作者机构：中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室 中国海洋大学水产学院 广西农产资源化学与生物技术重点实验室 

出 版 物：《渔业科学进展》 (Progress in Fishery Sciences)

年 卷 期：2024年第4期

页      面：166-174页

核心收录：

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

基　　金：国家自然科学基金(31902400) 广西农产资源化学与生物技术重点实验室开放基金(2022KF07)共同资助 

主　　题：核酸释放剂 重组酶聚合酶扩增(RPA) 侧流层析试纸条(LFD) 虾肝胰腺 病原快速检测 

摘      要：为摆脱常规核酸样品提取步骤繁琐、耗时等问题，实现真正的现场快速检测，本研究致力于研制和优化一种对虾肝胰腺中DNA样品的核酸快速制备试剂，即核酸释放剂，适用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplication,RPA)与侧向流层析试纸条技术(lateralflow dipstick, LFD)结合的RPA-LFD技术检测。实验优选20～100 mmol/L Tris-HCl、50～250 mmol/L KCl、0.01%～0.10%十二烷基硫酸锂(LDS)、0.5%～2.0%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、1～5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EGTA2Na)、0.5～5.0 mmol/L牛血清白蛋白(BSA)、1～5 mg/mL明胶、0.01%～0.10%海藻糖、1%～5%甜菜碱等配制成核酸释放剂。以对虾肝肠孢虫(Enterocytozoonhepatopenaei,EHP)阳性样本和阴性样本对核酸释放剂各组分间配比进行优化，采集绿豆大小的对虾肝胰腺组织加入100μL核酸释放剂，100℃加热3 min，取上清液进行RPA-LFD反应，测试各组分不同浓度配比；并以对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)阳性样品及阴性样品作为检测模板对优化后核酸释放剂再次验证。结果显示，核酸释放剂的各组分最佳配比为100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L KCl、0.02%LDS、0.5%Triton X-100、1 mmol/L EGTA2Na、0.05%海藻糖、1 mg/mL明胶、0.5 mmol/L BSA、2%甜菜碱。RPA-LFD方法检测可显著区分阳性和阴性样品。本研究优化的核酸释放剂，适用于RPA-LFD检测对虾肝胰腺病原DNA样品的制备，有效避免了常规DNA样品繁琐、耗时的制备步骤，极大地提高了核酸水平病原检测效率。