密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

作     者：于吉锋 谢晶 黄勇 肖璐 林毅 曹冶 叶勇刚 魏勇 吴学婧 李江凌 康润敏 YU Jifeng;XIE Jing;HUANG Yong;XIAO Lu;LIN Yi;CAO Ye;YE Yonggang;WEI Yong;WU Xuejing;LI Jiangling;KANG Runmin

作者机构：四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室成都610066 四川农业大学动物医学院成都611130 

出 版 物：《中国畜牧兽医》 (China Animal Husbandry & Veterinary Medicine)

年 卷 期：2024年第51卷第2期

页      面：668-677页

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：四川省自然科学基金(2022NSFSC0081) 四川省基本科研业务专项(SASA202302) 四川省区域创新合作项目(2023YFQ0037) 四川省财政运行专项(SASA2023CZYX006) 

主　　题：兔出血症病毒2型(RHDV2) 病毒样颗粒(VLP) 密码子偏好性 重组杆状病毒 免疫原性 

摘      要：[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。