补肾活血方联合人脐带血间充质干细胞修复小鼠膝关节软骨缺损的实验研究

作     者：岑芊瑶 刘江源 曾庆贺 温经渊 吴丛姿 王旭 吴震 金红婷 陈佳丽 CEN Qianyao;LIU Jiangyuan;ZENG Qinghe;WEN Jingyuan;WU Congzi;WANG Xu;WU Zhen;JIN Hongting;CHEN Jiali

作者机构：浙江中医药大学第二临床医学院浙江杭州310053 浙江中医药大学骨伤研究所浙江杭州310053 浙江省立同德医院浙江杭州310012 

出 版 物：《中医正骨》 (The Journal of Traditional Chinese Orthopedics and Traumatology)

年 卷 期：2023年第35卷第12期

页      面：5-13,24页

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

基　　金：浙江省中医药科技计划项目(2023ZL037) 浙江省基础公益研究计划项目(LGF20H270005)。 

主　　题：膝关节 软骨,关节 小鼠 软骨缺损 间质干细胞 脐带血 补肾活血方 骨微结构 动物实验 

摘      要：目的:探讨补肾活血方联合人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSCs)修复小鼠膝关节软骨缺损的效果及作用机制。方法:将24只10周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、hUCB-MSCs组和补肾活血方联合hUCB-MSCs组,每组6只。除对照组外,其余3组均用针头在小鼠股骨髁滑车关节面上造一个直径0.45 mm、深1 mm的圆柱形缺损。分别于造模后第1周、第2周、第3周,向hUCB-MSCs组、补肾活血方联合hUCB-MSCs组小鼠膝关节腔内注射10μL的hUCB-MSCs悬液(200个细胞·μL^(-1)),向对照组和模型组小鼠膝关节腔内注射10μL的生理盐水;各组小鼠均每周注射1次。造模后第2天,补肾活血方联合hUCB-MSCs组小鼠给予补肾活血方浓缩液(20μL·g-1)灌胃,对照组、模型组和hUCB-MSCs组小鼠每天给予等量生理盐水灌胃;各组小鼠均每天灌胃1次,共4周。灌胃结束后第2天,脱颈处死各组小鼠,切取小鼠右侧膝关节,以Micro-CT观察小鼠膝关节软骨缺损区骨微结构;以阿尔新蓝-苏木素染色观察膝关节软骨缺损区软骨退变情况,并采用国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International,OARSI)评分对关节软骨退变情况进行评估;采用免疫组织化学染色测定小鼠膝关节软骨缺损区软骨中Ⅱ型胶原蛋白α1链(collagen typeⅡalpha 1 chain,Col2a1)和基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)的表达量。结果:①小鼠膝关节软骨缺损区骨微结构观察结果。对照组、hUCB-MSCs组和补肾活血方联合hUCB-MSCs组小鼠膝关节软骨缺损区骨松质的骨密度均高于模型组(LSD-t=18.425,P=0.000;LSD-t=-10.186,P=0.000;LSD-t=-7.487,P=0.000),骨体积分数均高于模型组(LSD-t=7.242,P=0.002;LSD-t=-5.243,P=0.006;LSD-t=-5.441,P=0.006),骨小梁厚度均大于模型组(LSD-t=7.575,P=0.002;LSD-t=-10.005,P=0.002;LSD-t=-5.409,P=0.006),骨小梁数量均多于模型组(LSD-t=9.166,P=0.000;LSD-t=-10.014,P=0.000;LSD-t=-9.147,P=0.000),骨小梁分离度均小于模型组(LSD-t=-9.120,P=0.000;LSD-t=10.375,P=0.000;LSD-t=7.650,P=0.002);hUCB-MSCs组骨松质骨小梁数量少于对照组(LSD-t=3.027,P=0.039);其余各组之间两两比较,差异均无统计学意义。②小鼠膝关节软骨缺损区软骨退变情况观察结果。与对照组相比,模型组小鼠关节软骨退变明显;与模型组相比,hUCB-MSCs组和补肾活血方联合hUCB-MSCs组小鼠关节软骨退变较轻。对照组、hUCB-MSCs组和补肾活血方联合hUCB-MSCs组小鼠OARSI评分均低于模型组(LSD-t=-11.762,P=0.000;LSD-t=10.947,P=0.000;LSD-t=14.779,P=0.000),补肾活血方联合hUCB-MSCs组和对照组小鼠OARSI评分均低于hUCB-MSCs组(LSD-t=-5.635,P=0.005;LSD-t=-3.443,P=0.026),对照组小鼠OARSI评分低于补肾活血方联合hUCB-MSCs组(LSD-t=-5.914,P=0.004)。③小鼠膝关节软骨缺损区软骨Col2a1和MMP13表达量测定结果。对照组、hUCB-MSCs组和补肾活血方联合hUCB-MSCs组小鼠膝关节软骨缺损区软骨Col2a1阳性表达面积均大于模型组(LSD-t=9.863,P=0.000;LSD-t=45.990,P=0.000;LSD-t=-17.406,P=0.000),补肾活血方联合hUCB-MSCs组小鼠膝关节软骨缺损区软骨Col2a1阳性表达面积大于hUCB-MSCs组(LSD-t=3.623,P=0.022),补肾活血方联合hUCB-MSCs组和hUCB-MSCs组小鼠膝关节软骨缺损区软骨Col2a1阳性表达面积与对照组的差异均无统计学意义(LSD-t=-1.643,P=0.176;LSD-t=0.533,P=0.623)。对照组、hUCB-MSCs组和补肾活血方联合hUCB-MSCs组MMP13阳性细胞数占比均低于模型组(LSD-t=-14.299,P=0.001;LSD-t=9.688,P=0.001;LSD-t=15.638,P=0.000),补肾活血方联合hUCB-MSCs组MMP13阳性细胞数占比低于hUCB-MSCs组和对照组(LSD-t=-11.488,P=0.007;LSD-t=3.578,P=0.023),hUCB-MSCs组MMP13阳性细胞数占比高于对照组(LSD-t=-9.425,P=0.000)。结论:补肾活血方联合hUCB-MSCs能明显改善小鼠膝关节软骨缺损区骨微结构,修复软骨缺损,其作用机制可能与上调Col2a1的表达和抑制MMP13的表达有关。