髓样分化蛋白2介导脓毒症相关性脑病的机制研究

作     者：贾琪 顾婷婷 李仪 王嘉炜 李谨 方宗平 张西京 Jia Qi;Gu Tingting;Li Yi;Wang Jiawei;Li Jin;Fang Zongping;Zhang Xijing

作者机构：空军军医大学第一附属医院重症医学科陕西西安710032 空军军医大学第一附属医院麻醉与围术期医学科陕西西安710032 

出 版 物：《中华危重病急救医学》 (Chinese Critical Care Medicine)

年 卷 期：2023年第35卷第11期

页      面：1200-1206页

核心收录：

学科分类：100218[医学-急诊医学] 1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(81871603 82272190)。 

主　　题：脓毒症相关性脑病 神经炎症 凋亡 坏死性凋亡 髓样分化蛋白2 

摘      要：目的通过脂多糖(LPS)建立脓毒症相关性脑病(SAE)体外模型,探讨人髓样分化蛋白2(MD2)在LPS导致神经元死亡过程中的作用及内在机制。方法选择健康C57BL/6J孕鼠,孕期14~18 d,取胎鼠脑皮质组织,用0(空白对照组)、1、5和10 g/L的LPS刺激神经元后24 h,检测乳酸脱氢酶(LDH)释放量,观察神经元死亡情况,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子白细胞介素(IL-6、IL-1β)水平,以确定建立SAE体外神经炎症模型的最佳LPS剂量。将细胞分为空白对照组和LPS组,用原位末端缺刻标记法(TUNEL)染色检测细胞凋亡情况,用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测相关蛋白标志物活化天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表达、坏死性凋亡相关蛋白神经元受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3(RIPK3)及磷酸化RIPK3(p-RIPK3)水平,用免疫荧光化学染色检测p-RIPK3和微管相关蛋白2(MAP2)的表达,以评估细胞死亡类型及神经元死亡程度;用Western blotting法检测MD2表达,免疫荧光化学染色观察p-RIPK3及MD2在神经元中的表达和分布,以评估MD2是否参与炎症反应促进神经元死亡。此外,将细胞分为空白对照组、LPS组和MD2干扰肽组(LPS+TC组),检测IL-6、IL-1β、LDH水平,评估干扰MD2能否减轻LPS诱导的神经炎症。结果10 g/L LPS可诱导明显的神经元死亡,该浓度刺激神经元24 h后LDH释放量较空白对照组明显增加(相对释放量:1.45±0.04比1.00±0.00,P0.01),神经元发生凋亡及坏死性凋亡,炎症因子IL-6、IL-1β水平显著增加〔IL-6(相对水平):1.94±0.04比1.00±0.00,IL-1β(相对水平):1.53±0.09比1.00±0.00,均P0.01〕。与空白对照组比较,LPS组TUNEL检测细胞凋亡明显增多,活化caspase-3表达明显增加(活化caspase-3/GAPDH:1.55±0.10比1.00±0.00,P0.01),p-RIPK3/RIPK3比值明显升高(相对值:1.54±0.06比1.00±0.00,P0.05),神经元周围p-RIPK3表达显著增多,提示脓毒症环境下神经元发生显著凋亡及坏死性凋亡。同时,与空白对照组比较,LPS组MD2表达量显著增加(MD2/GAPDH:1.91±0.07比1.00±0.00,P0.01),神经元周围MD2表达显著增多,提示LPS诱导的MD2上调可能在脓毒症神经炎症及诱导神经元死亡中发挥关键作用。此外,与LPS组比较,MD2干扰肽能够降低炎症因子IL-6、IL-1β的表达水平〔IL-6(相对水平):1.16±0.08比1.94±0.04,IL-1β(相对水平):1.15±0.05比1.75±0.09,均P0.01〕,减少LDH释放(相对释放量:1.09±0.01比1.44±0.04,P0.05)。结论LPS刺激神经元通过MD2诱导神经元炎症反应,最终导致神经元发生凋亡和坏死性凋亡;干扰MD2功能可减轻炎症,抑制神经元死亡。