虫草素体外抗弓形虫的效果及其作用机制的探究
Study on the anti Toxoplasma gondii effect and mechanism of cordycepin作者机构:临沂大学农林科学学院山东临沂276000
出 版 物:《中国预防兽医学报》 (Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine)
年 卷 期:2023年第45卷第8期
页 面:837-845页
学科分类:090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
基 金:国家自然科学基金(31660614) 大学生创新创业训练计划项目(X202210452489)
摘 要:为探究虫草素抗弓形虫的效果及作用机制,本研究将不同浓度的虫草素与弓形虫RH株共同作用48 h后,采用CCK8法筛选对细胞安全的虫草素浓度。结果显示,以1μg/mL~200μg/mL(以对细胞的抑制率均为0判定)的虫草素为细胞的安全浓度。将巨噬细胞接种弓形虫RH-GFP株,同时分别加入1μg/mL~100μg/mL虫草素,根据弓形虫的荧光强度,计算虫草素对弓形虫的半数抑制浓度(IC50)。结果显示,虫草素对弓形虫的IC50为31.24μg/mL,且其对弓形虫的抑制作用与虫草素的浓度呈正相关。将巨噬细胞接种弓形虫RH株,同时加入100μg/mL虫草素,2 h后采用间接免疫荧光试验(IFA)检测并统计黏附与侵入细胞的弓形虫数量,分析虫草素对弓形虫黏附与侵入细胞的影响;24 h后采用吉姆萨染色后统计细胞感染率;收集上述各组细胞样品,一部分细胞采用qPCR检测细胞中弓形虫B1基因的转录水平,分析虫草素对弓形虫增殖的影响;一部分细胞采用IFA检测并统计每孔细胞100个空泡(PV)中的弓形虫速殖子的数量,分析虫草素对弓形虫复制水平的影响。结果显示,与感染RH株的对照细胞相比,虫草素处理组黏附细胞的弓形虫数量极显著上升(P0.01),侵入细胞的弓形虫数量极显著下降(P0.01);弓形虫对细胞的感染率及细胞中弓形虫B1基因的转录水平均极显著下降(P0.01);虫草素处理组细胞中弓形虫速殖子数量为1或2的PV数量极显著升高,数量为4和8及以上的PV数量极显著减少(P0.01)。上述结果表明,虫草素在体外能够显著抑制弓形虫对细胞侵袭力、细胞感染率、弓形虫的增殖及复制水平。将小鼠腹腔巨噬细胞分为3组:空白对照组(Blank control)、感染RH株的对照组(***)和虫草素与RH株共培养组(***+Cor),各组细胞培养24 h后采用ELISA试剂盒检测各组细胞上清液中各细胞因子的分泌水平;采用生化试剂盒测定各组细胞的各生化指标;采用western blot检测各组细胞中TLR4/NF-κB炎症反应信号通路相关蛋白TLR4、p-NF-κB p65和Nrf2/HO-1氧化应激信号通路相关蛋白Nrf2、HO-1的表达量。ELISA结果显示,与空白对照组相比,***组中TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平均极显著升高(P0.01);与***组相比,***+Cor组中TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平均极显著降低(P0.01)。生化指标测定结果显示,与空白对照组相比,***组中丙二醛(MDA)的含量极显著升高(P0.01),谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量极显著下降(P0.01);与***组相比,***+Cor组中MDA的含量极显著降低(P0.01),GSH和SOD的含量极显著升高(P0.01)。Western blot结果显示,与空白对照组相比,***组中TLR4、p-NF-κB p65、Nrf2和HO-1的表达量均极显著升高(P0.01);与***组相比,***+Cor组中TLR4和p-NF-κB p65蛋白的表达水平均极显著降低(P0.01),Nrf2和HO-1蛋白的表达水平均极显著升高(P0.01)。以上研究结果首次证实,虫草素在体外可能通过调控TLR4/NF-κB和Nrf2/HO-1信号通路发挥抗炎和抗氧化活性以抑制弓形虫在小鼠腹腔巨噬细胞内的增殖和复制。本研究对虫草素抗弓形虫作用及机制的初步研究及其在兽医临床中的应用提供参考依据。