赖氨酸乙酰转移酶7的冷冻电镜全长结构分析

作     者：郑国培 曹骎 沈键锋 ZHENG Guopei;CAO Qin;SHEN Jianfeng

作者机构：上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科上海200011 上海交通大学生命科学技术学院Bio-X研究院上海200030 

出 版 物：《上海交通大学学报(医学版)》 (Journal of Shanghai Jiao tong University:Medical Science)

年 卷 期：2023年第43卷第9期

页      面：1099-1106页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金面上项目(81972667) 上海交通大学医学院“双百人”项目(20191817) 

主　　题：赖氨酸乙酰转移酶 蛋白质翻译后修饰 乙酰化 冷冻电镜技术 

摘      要：目的·利用冷冻电镜技术分析人源性赖氨酸乙酰转移酶7(lysine acetyltransferase 7,KAT7)的全长蛋白结构,获得人源KAT7的轮廓信息。方法·使用pGEX-4T1载体和人源KAT7全长基因构建重组蛋白表达质粒pGEX-4T1-GST-KAT7,在原核蛋白表达体系BL21(DE3)中表达KAT7蛋白,使用GST亲和层析获得GST-KAT7重组蛋白;在利用TEV蛋白酶去除GST蛋白标签后,通过HiLoad 16/600 Superdex 75 pg体积排阻色谱进一步分离纯化KAT7蛋白。将获取的蛋白样品利用蛋白质印迹法(Western blotting)对KAT7进行鉴定,使用负染电镜筛选样品并初步观察蛋白形貌;使用冷冻电镜收集数据,利用冷冻电镜数据分析软件CryoSparc挑选蛋白颗粒并分析KAT7全长蛋白的空间结构;通过UCSF Chimera软件将蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)中KAT7的MYST结构域模型(5GK9)、AlphaFold预测模型与生成的结构模型进行匹配分析。结果·利用亲和层析成功纯化人源性KAT7的全长蛋白,并通过体积排阻色谱获得高纯度的KAT7蛋白;在通过Western blotting鉴定KAT7后,利用负染电镜、冷冻电镜及单颗粒重构技术初步解析了KAT7全长蛋白的空间结构,并通过三维优化处理获得了分辨率约为10Å的初步三维结构模型;KAT7全长蛋白空间结构呈不规则的半环状,已有的MYST结构域模型(PDB:5GK9)可匹配入KAT7全长模型的C端部分,调整后的AlphaFold预测模型也可匹配KAT7全长结构模型。结论·利用冷冻电镜技术初步分析了人源性KAT7的全长蛋白空间结构模型。