毕赤酵母甲酸脱氢酶辅因子特异性改造及应用

作     者：胡力元 刘璐瑶 白仲虎 杨艳坤 金坚 HU Liyuan;LIU Luyao;BAI Zhonghu;YANG Yankun;JIN Jian

作者机构：工业生物技术教育部重点实验室(江南大学)江苏无锡214122 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心(江南大学)江苏无锡214122 江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心江苏无锡214122 江南大学生命科学与健康工程学院江苏无锡214122 

出 版 物：《食品与发酵工业》 (Food and Fermentation Industries)

年 卷 期：2023年第49卷第13期

页      面：9-16页

核心收录：

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学] 

基　　金：国家重点研发计划项目(2021YFC2100203) 国家轻工技术与工程一流学科自主课题项目(LITE2018-24) 

主　　题：辅因子再生系统 巴斯德毕赤酵母 甲酸脱氢酶 酶促反应动力学 还原胺化反应 NADPH再生 

摘      要：甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH,EC 1.***.1.2)在发酵工业中常被应用于酶法辅因子再生系统。为了改造巴斯德毕赤酵母甲酸脱氢酶(FDH from Komagataella phaffii,Kph FDH)的辅因子特异性并应用于体外NADPH辅因子再生系统,研究基于多序列比对和文献调研的结果,确定了D195、Y196为突变位点,构建了16个突变体,并表征了野生型和突变体的比酶活力和酶促反应动力学。得到最优的NADP+特异性突变体为Kph FDH D195Q/Y196R,其对NADP+的催化效率(k_(cat)/K_(m))为1.967 L/(mmol·s),催化特异性比率[(k_(cat)/K_(m)NADP+)/(k_(cat)/K_(m)NAD+)]为36.426;以NADP+作为辅因子时,对甲酸的催化效率(k_(cat)/K_(m))为0.020 L/(mmol·s)。最后成功将该突变体应用于苯丙酮酸还原胺化反应中的NADPH再生,200 min内几乎完全反应。该研究填补了毕赤酵母FDH辅因子特异性改造方面的研究空白,为发酵工业中NADPH辅因子再生系统应用提供了一种工具酶,同时也为进一步改造该酶的辅因子特异性提供了一种出发突变体。