编码N端截短的IκBα突变体重组腺病毒的构建与鉴定

作     者：周林福 朱毅 朱自路 殷凯生 ZHOU Lin-fu;ZHU Yi;ZHU Zi-lu;YIN Kai-sheng

作者机构：南京医科大学第一附属医院呼吸内科 南京医科大学生物化学与分子生物学系江苏南京210029 

出 版 物：《中国病理生理杂志》 (Chinese Journal of Pathophysiology)

年 卷 期：2006年第22卷第9期

页      面：1802-1807页

核心收录：

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100104[医学-病理学与病理生理学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学青年科学基金资助项目(No. 30400191) 江苏省"135"工程重点学科基金资助项目(No. 20013102) 

主　　题：克隆,分子 IκBα突变体 NF-κB 腺病毒科 基因疗法 哮喘 

摘      要：目的:通过去除N端丝氨酸32/36磷酸化位点,获得人胎盘组织IκBα突变体(IκBαM)基因,构建其复制缺陷型重组腺病毒(AdIκBαM),并进行体外表达和活性检测。方法:PCR定点克隆IκBαM基因(203-1003bp),亚克隆至pShuttle和pGEM-T,进行PCR、双酶切、DNA测序和同源性分析。将重组质粒pShuttle-IκBαM中含CMV启动子、IκBαMcDNA和PolyA信号的表达单元定向插入Ad5腺病毒载体,构建成重组腺病毒AdIκBαM,再经脂质体介导共转染293细胞进行包装。Western blotting检测AdIκBαM在293细胞中蛋白表达情况,电泳迁移率实验观察AdIκBαM抑制佛波酯诱导的ECV304细胞核因子κB(NF-κB)激活的作用。结果:成功克隆长801bp的新型IκBαM基因,与Gen Bank中登陆的IκBα基因(接受号M69043)相应核苷酸序列一致。所制备的AdIκBαM滴度为4.0×1012pfu/L。AdIκBαM介导IκBαM基因在293细胞中表达,并以剂量依赖性方式显著抑制佛波酯诱导的ECV304细胞NF-κB活化。结论:AdIκBαM有效介导IκBαM基因表达并特异性抑制NF-κB活性,有望应用于哮喘的基因治疗。