宫颈癌顺铂耐药相关基因筛选及KRT6A表达对顺铂耐药宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响

作     者：夏娜娜 杨安银 余敏敏 XIA Na-na;YANG An-yin;YU Min-min

作者机构：南京中医药大学附属南京医院、南京市第二医院妇科江苏南京210003 

出 版 物：《中华实用诊断与治疗杂志》 (Journal of Chinese Practical Diagnosis and Therapy)

年 卷 期：2023年第37卷第3期

页      面：252-260页

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：江苏省医学重点人才基金(ZDRCA2016072) 南京中医药大学自然科学基金(XZR2020070)。 

主　　题：宫颈癌 差异表达基因 顺铂耐药 KRT6A基因 SiHa细胞 SiHa/DDP细胞 

摘      要：目的应用生物信息学方法筛选宫颈癌顺铂耐药相关的枢纽基因,探讨KRT6A表达对顺铂耐药宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响。方法(1)收集TCGA数据库306份宫颈癌标本的mRNA表达数据,基于GDSC数据库,应用R软件包“pRRophetic预测宫颈癌样本顺铂化疗的敏感度,采用线性回归分析顺铂的半数抑制浓度(the half inhibitory concentration,IC_(50))。依据IC_(50)值将宫颈癌样本分为顺铂敏感组和耐药组,应用limma软件包进行差异表达mRNA分析,对其进行基因本体(gene ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,应用Cytoscape软件构建差异表达基因的蛋白互作网络,进行模块分析并筛选枢纽基因。选择KRT6A基因进行细胞实验。(2)取对数生长期SiHa和顺铂耐药SiHa(SiHa/DDP)细胞,采用实时荧光定量PCR法检测KRT6A mRNA相对表达量;分别应用0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/L顺铂处理48 h,采用CCK-8法检测2组细胞增殖率。(3)取对数生长期SiHa/DDP细胞分为转染组(转染siRNA-KRT6A)和对照组(转染siRNA-NC),转染48 h,2组采用实时荧光定量PCR法检测KRT6A mRNA相对表达量,采用Western blot法检测KRT6A蛋白相对表达量;然后采用CCK-8法检测应用0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/L顺铂处理48 h细胞增殖,计算顺铂的IC_(50)值。转染48 h取转染组和对照组细胞,应用5 mg/L(IC_(50)值)浓度的顺铂处理48 h,采用流式细胞术检测处理0、48 h时细胞凋亡。结果(1)顺铂敏感组与顺铂耐药组差异表达基因有190个,与顺铂敏感组比较,顺铂耐药组74个基因表达上调、116个基因表达下调。GO分析结果提示差异表达基因参与表皮发育、肽酶活性调节、角质形成细胞分化、蛋白质水解和水解酶活性的负调控等生物过程,其产物参与细胞间连接、顶端质膜、中间体、侧质膜等细胞组分,发挥丝氨酸型内肽酶抑制剂活性、氧化还原酶活性、钙依赖性蛋白结合和细胞骨架的结构成分等生物学分子功能。KEGG富集分析结果显示,差异表达基因主要富集于雌激素信号通路、补体和凝血级联反应、白细胞介素-17信号通路、酪氨酸代谢、肾素分泌和组氨酸代谢等。通过蛋白互作网络和聚类分析得到6个宫颈癌顺铂耐药的枢纽基因,分别为KRT6A、KRT5、KRT14、SPRR1B、KRT16和SPRR1A。(2)SiHa/DDP细胞KRT6A mRNA相对表达量(6.310±0.417)高于SiHa细胞(1.000±0.110)(t=21.314,P0.001)。2.5、5、10、20 mg/L顺铂处理48 h,SiHa/DDP细胞增殖率[(72.461±3.598)%、(70.862±3.474)%、(63.013±3.565)%、(47.754±5.023)%]均高于SiHa细胞[(50.702±6.477)%、(22.593±4.413)%、(5.964±1.396)%、(3.555±1.263)%](t=5.086,P=0.007;t=14.886,P0.001;t=25.811,P0.001;t=14.781,P0.001)。(3)转染48 h,转染组KRT6A mRNA及蛋白相对表达量(0.290±0.053、0.457±0.046)均低于对照组(0.987±0.023、0.457±0.046)(t=20.880,P0.001;t=10.228,P=0.001)。1.25、2.5、5、10、20 mg/L浓度顺铂处理48 h,转染组细胞增殖率[(65.676±3.358)%、(53.150±1.902)%、(40.932±2.455)%、(33.580±2.949)%、(18.042±3.183)%]均低于对照组[(75.557±3.573)%、(66.144±3.843)%、(53.801±2.276)%、(41.683±1.422)%、(28.953±3.065)%](t=3.529,P=0.024;t=5.294,P=0.006;t=6.658,P=0.003;t=4.287,P=0.013;t=4.276,P=0.013)。5 mg/L顺铂处理0、48 h,转染组细胞凋亡率[(14.039±2.410)%、(32.963±3.133)%)]高于对照组[(4.455±1.028)%、(23.004±3.613)%](t=6.377,P=0.003;t=3.594,P=0.022)。结论宫颈癌顺铂耐药的枢纽基因主要有KRT6A、KRT5、KRT14、SPRR1B、KRT16和SPRR1A;下调KRT6A表达可抑制SiHa/DDP细胞增殖,促进SiHa/DDP细胞凋亡,增加其对顺铂的敏感度,KRT6A基因可能是逆转宫颈癌顺铂耐药的潜在靶点。