miRNA-20a在脂多糖诱导A549细胞焦亡和炎症反应中的作用与机制研究

作     者：陶慧娴 王木子 郭艳 邹芸苏 卢志涛 丁溢芳 周晓光 许卫东 Tao Huixian;Wang Muzi;Guo Yan;Zou Yunsu;Lu Zhitao;Ding Yifang;Zhou Xiaoguang;Xu Weidong

作者机构：张家港市第一人民医院儿科苏州215600 南京医科大学附属儿童医院新生儿医疗中心南京210008 

出 版 物：《中华新生儿科杂志（中英文）》 (Chinese Journal of Neonatology)

年 卷 期：2023年第38卷第2期

页      面：107-114页

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100104[医学-病理学与病理生理学] 10[医学] 

基　　金：苏州市产业技术创新专项(SYSD2017005) 张家港市卫计系统青年科技项目(ZJGQNKJ201703)。 

主　　题：微小RNA-20a 细胞焦亡 脂多糖 人肺泡上皮A549细胞株 

摘      要：目的探讨miRNA-20a在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的A549细胞焦亡与炎症反应中的作用与调控机制。方法培养人肺泡上皮A549细胞,以LPS为刺激物建立细胞焦亡及炎症反应模型,给予LPS+三磷酸腺苷刺激为LPS组,未给予刺激为空白对照组,验证模型是否成功。将A549细胞根据转染物质分为miRNA-20a模拟物(mimics)组、mimics-阴性对照(negative control,NC)组、miRNA-20a抑制物(inhibitor)组和inhibitor-NC组,构建过表达及沉默miRNA-20a的A549细胞模型,各组细胞在转染24 h后给予LPS+三磷酸腺苷刺激。构建TLR4-3 UTR双荧光素酶报告基因载体质粒,包括野生型(WT)载体质粒TLR4-3 UTR-WT1、TLR4-3 UTR-WT2及相应的变异型(MUT)载体质粒TLR4-3 UTR-MUT1、TLR4-3 UTR-MUT2,用双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-20a的靶基因。采用实时荧光定量聚合酶链反应、免疫印迹试验及酶联免疫吸附试验检测各组焦亡标志因子消皮素D(gsdermin D,GSDMD),炎症因子凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β),以及信号分子Toll样受体4(Toll-like receptor-4,TLR4)、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)mRNA及蛋白表达。免疫荧光检测各组细胞TLR4表达和NF-κB入核情况。结果LPS组A549细胞GSDMD、ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1βmRNA和蛋白表达量均高于空白对照组(P0.05),模型建立成功。mimics组miRNA-20a表达量高于mimic-NC组(P0.05),inhibitor组miRNA-20a表达量低于inhibitor-NC组(P0.01)。双荧光素酶报告基因实验显示,TLR4-3 UTR-WT与miRNA-20a mimics共转染组的相对荧光值低于TLR4-3 UTR-WT与mimics-NC共转染组(P0.05)。mimics组LPS介导的A549细胞GSDMD、ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达水平均低于mimics-NC组(P0.05),inhibitor组GSDMD、ASC、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达水平均高于inhibitor-NC组(P0.05)。结论在LPS诱导的A549细胞焦亡及炎症反应中,miRNA-20a可能经TLR4/NF-κB信号通路对细胞焦亡及炎症反应产生抑制作用。